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目的:血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一群游走的、骨髓衍生的、与胚胎血管母细胞相似的细胞群,是血管内皮的前体细胞,能进一步增殖、分化为内皮细胞。新近研究表明,EPCs不仅参与胚胎期的血管发育,也存在于成年机体的骨髓及外周血,在成体血管新生中起重要作用。研究发现,EPCs在冠心病的发生、发展中扮演了重要角色,EPCs数量减少预示血管内皮修复能力降低,心血管疾病发生率增高。EPCs参与了出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程,EPC与血管新生的关系展现了其潜在的治疗价值,有广阔的发展前景。内皮素-1(ET-1)是迄今为止被认为是最强的血管收缩肽,。近来一些研究显示:内皮素与多种人类疾病有关,包括粥样硬化、高血压、血管痉挛、以及充血性心衰的心肌肥厚和重塑。在高血压和冠状动脉疾病患者,其血浆ET-1浓度是升高的。在粥样斑块局部也发现增高的ET-1浓度,认为是由于内皮细胞损伤、剪切力、缺血等因素所至的血管ET-1产生增加。有趣的是,ET-1及内皮素系统被认为是疾病与健康的双刃剑,一方面,ET-1通过血管平滑肌细胞(VSMC)表面的ET受体亚单位A(ETA)介导了细胞增殖和血管收缩;另一方面,通过内皮细胞表面的ETB受体介导了NO和前列环素的产生和血管舒张。ET-1对EPCs有何影响,目前未见相关报导。本实验的目的就是通过ET-1对体外培养的EPCs进行干预,以明确ET-1对EPCs功能的影响,并进一步探讨其信号转导机制。方法:实验血液样本来自10位健康男性中青年志愿者。采用密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上。M199培养基培养7d的贴壁细胞供实验用。贴壁细胞随机分成6组,分别为对照组、不同浓度ET-1组、ET-1+P13K激酶抑制剂(Ly294002)组及ET-1+ETB受体阻滞剂量(BQ788)。每组3孔,无血清培养基培养24h;激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,分别采用细胞计数法、MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定实验和体外血管形成试剂盒来观察EPCs的增殖、迁移、黏附和体外血管形成能力,免疫印迹杂交法(Western blot)测定磷酸化Akt蛋白和磷酸化eNOS蛋白含量。结果:1.EPCs的鉴定分离获得的单个核细胞培养7d后形成了梭形的内皮样细胞。用acLDL-Dil和FITC-UEA-Ⅰ对细胞染色后,通过激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-Ⅰ和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,在倒置荧光显微镜下(x200)计数15个随机选择视野的EPCs。2.ET-1对外周血EPCs数量的影响不同浓度的ET-1与EPCs培养24h显示ET-1能增加EPCs数量,并且EPCs数量随ET-1浓度增加而增加,Ly294002可显著抑制其数量增加效应;在1nM组中亦可见EPCs数量在ET-1作用24h时达峰。3.ET-1对外周血EPCs增殖功能的影响采用MTT比色法检测ET-1对EPCs增殖能力的影响,结果显示:ET-1显著增加EPCs的增殖能力,呈量效关系;Ly294002、BQ788显著抑制其促增殖效应。4.ET-1对外周血EPCs迁移功能的影响采用改良的Boyden小室检测ET-1对EPCs迁移能力的影响,在200倍显微镜下计数迁移的细胞。ET-1明显增加EPCs的迁移能力,呈浓度依赖性,Ly294002、BQ788显著抑制其促迁移能力。5.ET-1对外周血EPCs黏附功能的影响为了观察ET-1对外周血EPCs黏附能力的影响,先将不同浓度的ET-1与EPCs培养24h,然后将相同数量的EPCs重新接种到包被有人纤维连接蛋白的培养板上培养30min,结果显示ET-1明显增加了EPCs的黏附能力,呈浓度依赖性,Ly294002、BQ788显著降低其促黏附功能。6.ET-1对外周血EPCs体外血管形成能力的影响体外血管形成实验结果显示,ET-1明显促进EPCs的体外血管形成能力,Ly294002、BQ788显著降低其促血管形成功能。7.ET-1对外周血EPCs中磷酸化Akt蛋白和磷酸化eNOS蛋白表达的影响ET-1增加了EPCs的磷酸化Akt蛋白和磷酸化eNOS蛋白含量,并呈浓度依赖性,Ly294002、BQ788显著降低其促上述蛋白表达的效应。结论:1.可以从外周血中的单个核细胞分离和培养血管内皮祖细胞。2.ET-1增加外周血EPCs数量,增强EPCs的增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力,并具有量效关系。3.ET-1促进EPC中磷酸化Akt、磷酸化eNOS蛋白的表达,具有量效关系。4.ET-1促EPC血管新生活性由ETB介导,并与PI3K/Akt/eNOS信号通路的活化相关。