胆固醇广泛存在于动物各个组织中,是生成类固醇激素、维生素D和胆汁酸的重要原料,具有重要的生理功能。对蛋鸡来说,肝脏是合成胆固醇的主要器官。特别是在产蛋期,肝脏每天合成大量胆固醇,并以VLDL的形式转运至卵母细胞,最终形成卵黄。虽然,鸡肝脏胆固醇合成这一过程受到广泛的关注,但到目前为止对这一问题依然没有进行系统的研究。本研究以卢氏绿壳蛋鸡对研究对象,采用现代分子生物学手段对鸡产蛋期肝脏胆固醇合成调控的机制进行了系统的研究,初步阐明了鸡产蛋期肝脏胆固醇合成的分子调控机制,丰富了鸡脂质代谢调控理论,为改善肉蛋品质提供了新思路。本研究在课题组前期对产蛋前期（20周龄）和产蛋高峰期（30周龄）鸡肝脏组织RNA-seq分析的基础上,首先检测了鸡产蛋期肝脏胆固醇合成相关基因的表达变化情况,并鉴定出参与鸡肝脏胆固醇合成的基因;随后克隆了这一新基因的CDS,并对其特性和功能进行了研究;第三,通过对课题组已有的ChIP-seq数据库、雌激素处理的鸡肝脏组织RNA-seq数据库以及胆固醇合成通路相关基因的整合分析,鉴定出受雌激素调控的基因,并通过体内、体外实验进行验证;第四,通过对课题组已有的雌激素处理的鸡肝脏组织miRNA-seq数据库分析,并与鸡肝脏胆固醇合成通路相关基因进行整合分析,筛选雌激素通过miRNA调控的靶基因,利用双荧光素酶报告系统对其靶向关系进行验证,利用miRNA过表达分析miRNA对细胞内胆固醇合成的影响;最后,利用动物模型和细胞模型,研究了不同营养水平对鸡肝脏胆固醇合成的影响。具体研究结果如下:1.鸡胆固醇合成相关基因的鉴定蛋鸡胆固醇合成分子通路目前还没有系统的研究。参照哺乳动物胆固醇合成通路相关基因,结合课题组前期完成的产蛋前期（20周龄）和产蛋高峰期（30周龄）卢氏绿壳蛋鸡肝脏RNA-seq数据对胆固醇合成通路关键基因进行定量分析,在鸡肝脏组织中共鉴定出18个胆固醇合成基因,包括HMGCR、PMVK、CYP51、MVD、IDI1、FDPS、FDFT1、SQLE、MVK、LSS、GGPS1、LBR、MSMO1、NSDHL、HSD17B7、SC5D、DHCR7、DHCR24。和产蛋前期相比,这些基因在产蛋高峰期肝脏中表达量都显著上升。其中,胆固醇合成限速酶基因HMGCR的表达水平随性成熟的进展而升高,且与鸡产蛋率曲线的变化趋势一致。此外,哺乳动物胆固醇合成通路中的EBP基因不存在于鸡产蛋前期（20周龄）和产蛋高峰期（30周龄）卢氏绿壳蛋鸡肝脏RNA-seq数据,通过比较基因组学手段,在这一数据库中发现了类 EBP 基因:EBP-like。2.EBP-like基因的特性在鸡肝脏胆固醇合成中的作用EBP编码的蛋白是胆固醇合成通路中重要的酶,可以催化8-烯异构体变为7-烯异构体（7-eneisomer）。然而鸡肝脏组织转录组数据库中没有EB户基因。利用人EBP蛋白序列对鸡相关基因进行查询,发现鸡基因组中存在一类EBP基因,命名为EBP-like基因。首先克隆获得鸡EBP基因序列,并利用在线软件SMART分析了鸡EBP-like蛋白的功能结构域,构建了鸡EBP-like基因的进化树;接着利用qRT-PCR技术分析了 EBP-like基因在蛋鸡不同组织（肺、肝脏、脾脏、肾脏、腺胃、胸肌、胰腺、十二指肠、腿肌、卵巢）和不同发育时期肝脏组织（5、15、20、30、35和50周龄）的表达规律;采用基因功能获得与缺失策略,对EBP-like基因的在鸡肝脏胆固醇合成中的作用进行分析。结果表明,鸡EBP-like具有人EBP典型的结构域,在物种进化过程中相对保守;鸡EBP-like基因在不同组织中广泛表达,在肝脏组织中表达丰度较高,而在其他组织中表达量较低;鸡EBP-like基因过表达对胆固醇合成通路上游基因HMGCR,下游基因SC5D、DHCR7、DHCR24基因的表达没有影响（P<0.05）,对细胞内胆固醇含量也没有显著影响（P>0.05）,但干扰鸡EBP-like基因可导致SC5D、DHCR24、DHCR7等下游基因的表达水平以及细胞内胆固醇含量显著下降（P<0.05）。3.雌激素对鸡肝脏胆固醇合成的影响一般认为,鸡产蛋期肝脏胆固醇代谢受到雌激素的调控。雌激素处理（17β-雌二醇/体重=2mg/kg）卢氏绿壳蛋鸡12h后,血清中胆固醇含量显著升高（P<0.05）。与对照组相比,雌激素处理组HMGCR、CYP51A、SQLE、NSDHL、EBP-like、MVD、MSMO1、LSS、HSD17B7、FDPS、FDFT1、DHCR24、DHCR7基因的表达量都极显著升高（P<0.01）,SC5D、PMVK、MVK、IDI1、LBR基因的表达量无显著差异（P>0.05）,但GGPS1基因的表达量显著下调（P<0.05）。对雌激素处理后的上调基因转录起始位点上游5000 bp的序列进行了 ERE预测,发现HMGCR,CYP51,DHCR7,DHCR24,EBP-like,FDPS,SQLE,HSD17B7,LSS,MVD这10个基因存在有非典型的ERE位点,结合课题组前期ChIP-seq（雌激素受体α染色质免疫沉淀实验）数据库进行分析,推断雌激素通过ERE位点直接调控SQLE基因的表达。进一步的体内、体外实验显示,雌激素通过ERα受体调控SOLE基因的表达。4.雌激素通过miRNA调控胆固醇合成雌激素处理鸡后,其肝脏中胆固醇合成相关的13个基因上调,但只有其中一个基因确定受雌激素直接调控,其他基因可能由雌激素通过miRNA调控,从而调控胆固醇的合成。用生物信息学方法预测胆固醇合成相关的miRNA,利用课题组前期获得的雌激素处理的鸡肝脏组织miRNA-seq数据库,通过对雌激素处理与未处理鸡肝脏组织差异表达miRNA对应靶基因与雌激素处理后胆固醇合成通路相关基因的联合分析,鉴定出可能的雌激素通过miRNA调控的胆固醇合成基因:进一步用双荧光速酶报告系统对miRNA与胆固醇合成限速酶HMGCR基因和胆固醇合成的最后一步所需DHCR7基因的靶向关系进行验证,并在鸡肝脏原代细胞中进行miRNA过表达实验。结果表明,雌激素可以显著下调miR-27b-3p和miR-219b-3p的表达（P<0.05）;HMGCR基因3’UTR中序列与miR-27b-3p结合位点在不同物种中高度保守;DHCR7基因3’UTR中序列与miR-219b结合位点在不同物种中不保守。不同时期（5周龄,15周龄、20周龄和30周龄）蛋鸡肝脏中miR-27b-3p与HMGCR、miR-219b-3p和DHCR7的表达趋势相反,呈负相关。不同组织表达谱（肺、肝脏、脾脏、肾脏、腺胃、胸肌、胰腺、十二指肠、腿肌、卵巢）分析显示:HMGCR、DHCR7和miR-27b-3p、miR-219b-3p在各个组织中均广泛表达,但HMGCR和DHCR7基因在肝脏的表达丰度最高,miR-27b-3p 和 miR-219b-3p 在肝脏的表达丰度最低。miR-27b-3p mimics 和HMGCR 3’UTR野生型重组载体共转染DF1细胞后降低了荧光素酶活性,miR-27b-3p mimics使细胞内HMGCR基因表达量显著下降（P<0.05）,胞内胆固醇水平无显著差异（P>0.05）。说明雌激素可能通过调控miR-27b-3p的表达而介导HMGCR表达;导致胞内胆固醇水平差异不显著的原因可能由于miR-27b-3p可能还存在其他靶基因,对胆固醇水平多方面调控。miR-219b-3p mimics和DHCR7 3’UTR野生型重组载体共转染DF1细胞后降低了荧光素酶活性,miR-219b-3pmimics使细胞内DHCR7基因表达量显著下降（P<0.05）,胞内胆固醇水平显著下降（P<0.05）。说明雌激素可能通过调控miR-219b-3p的表达而介导DHCR7表达,从而使胞内胆固醇含量降低。5.油脂对胆固醇合成的影响以卢氏绿壳蛋鸡为研究对象,在原来基础日粮的基础上不添加或分别添加4%的大豆油饲喂30天后采集血清和肝脏组织进行分析,结果显示,日粮添加4%大豆油组血清胆固醇含量和对照组相比,差异不显著（P>0.05）。不同组间肝脏指数无显著差异（P>0.05）。肝脏HE染色表明,各组间肝细胞均排列紧密,分布较为均匀,细胞核居中,未发现病变。日粮中添加4%大豆油组,胆固醇合成基因表达量和对照组比均没有显著变化（P>0.05）。0.1mmol/L油酸处理鸡胚肝脏原代细胞后,胆固醇含量稍有下降,但是差异不显著（P>0.05）。胆固醇合成基因 HMGCR、MVD、FDPS、FDFT1、MVK、PMVK、IDI1、LBR、SC5D、SQLE、LSS、CYP51A1、MSMO1、NSDHL、HSD1 7B7、EBP-like、DHCR7、DHCR24 和对照组相比,表达水平显著上调（P<0.05）,GGPS1基因的表达水平和对照组差异不显著（P>0.05）。说明油酸对于胆固醇的合成有影响,一定浓度的油酸可以促进胆固醇合成通路相关基因的上升（P<0.05）。综上所述,蛋鸡胆固醇合成受多方面调控,雌激素可通过雌激素受体ERα调控SQLE基因从而影响胆固醇合成;雌激素也可介导miR-27b-3p和miR-219b-3p的表达从而影响靶基因HMGCR和DHCR7的表达,最终影响胆固醇合成:日粮大豆油可以影响胆固醇合成相关基因,从而影响胆固醇合成。该研究丰富了鸡肝脏脂质代谢调控理论,为进一步改善肉蛋品质奠定了理论基础。