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酶是生物催化的核心,酶催化多采用固定化酶法。但是传统的酶固定化方法中,酶的纯化和固定化需要分步完成,多步操作会造成生产成本的增加以及酶的损失,固定化载体的成本也是影响固定化酶工业应用的重要因素之一。本文借鉴固定化金属螯合层析技术(IMAC)这一较为成熟的蛋白纯化方法,研究原位纯化固定化酶技术。传统IMAC法是在目标蛋白末端引入六聚组氨酸标签(His-tag),当粗酶液流经金属螯合载体时,带His-tag的重组蛋白即通过金属螯合力与载体上的金属离子螯合起来,但是由于结合力较弱,结合上去的酶容易脱落,因此His-tag标签只适用于蛋白的纯化,而不能用于酶的固定化。因此本文选择以DAAO酶为研究对象,从本实验室构建的基因工程菌JM105/pGEMKT-R-DAAO出发,基于IMAC理论,利用基因工程方法将一种有别于我们常见的His-tag标签的强特异性吸附标签DAAO-Lab引入目标蛋白末端,将DAAO更牢固地结合在载体上,创建了一种适合工业应用,纯化、固定化一步完成的固定化酶。并建立一个应用IMAC技术制备工业用固定化酶的方法。从而解决了目前工业用酶在固定化中存在的步骤复杂、成本高等问题。构建基因工程菌JM105/pGEMKT-R-DAAO-Lab,首先在在实验室原有质粒pGEMKT-R-DAAO下游成功插入了新的标签结构Lab基因片段,成功在大肠杆菌JM105中表达了新的融合蛋白DAAO-Lab。而且该固定化酶可以用0.3M EDTA将蛋白和金属离子一起洗脱下来,载体可重新挂上金属离子进行新的纯化和固定化。对带有新标签结构的固定化酶研究结果表明:以本法制备的固定化D-氨基酸氧化酶较游离酶有更高的温度及pH稳定性;本固定化酶在温度为30℃,PH=8.0条件下有较好的催化活性;游离酶和固定化酶4℃储藏稳定性研究表明,经过酶的固定化,酶的储藏稳定性大大提高;催化100批仍未到达酶的半衰期;载体重复利用5批,固定化酶量没有明显降低。本研究为工业用固定化酶的研究开辟了一条新的途径。