论文部分内容阅读
背景和目的:
DNA聚合酶β(DNA polymeraseβ,polβ)是聚合酶X家族的一个成员,不同于聚合酶A、B、Y家族。其主要功能是碱基切除修复(Base excision repair,BER),在单核苷酸缺口的填补中起重要作用。因为其极高的错配率,被称为生物进化过程的“看家酶”。
polβ参与DNA的损伤修复及跨损伤进行DNA合成。正常情况下在体内成恒定的低水平表达。现已在人类肿瘤组织标本中如直肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、乳腺癌等多种癌中发现DNA polβ的高表达。从卵巢正常组织到癌变的过程中,polβ的表达量逐渐增加。肿瘤分化程度越低以及临床分期越高其表达量愈强。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是由作用于同源序列mRNA的长为21—23个核苷酸的双链RNA所介导的序列特异性、转录后基因沉默机制。
迄今为止,据已检索到的文献,国内外尚无运用RNAi技术阻抑卵巢癌细胞中polβ基因表达的相关研究报道。因此,课题利用RNAi技术沉默卵巢癌细胞中的polβ的表达,观察polβ抑制后肿瘤细胞的增殖活性以及对顺铂敏感性的变化。
实验方法:
利用已构建成功的针对polβ基因的siRNA(small interfering RNA,siRNA)重组质粒,转染人卵巢癌细胞HO-8910,通过荧光倒置显微镜观察转染效率；同时设空载体对照组(转染空载体pRNAT-U6.1)和空白对照组(未转染)；荧光定量PCR检测转染后HO-8910细胞中polβ mRNA的表达水平；用MTT法观察检测三个实验组细胞增殖能力变化；台盼蓝染色细胞计数法了解各组细胞对顺铂敏感性的变化。
实验结果:
1.已构建的靶向polβ基因的siRNA转染HO-8910后,48h后荧光倒置显微镜下可见大量绿色荧光颗粒。
2.转染polβ靶siRNA(pRNAT-U6.1-sipolβ)的HO-8910细胞,DNA聚合酶β基因的mRNA表达水平明显降低,与对照组相比,差别存在高度显著性(P<0.01)。而转染无关siRNA(pRNAT-U6.1)HO-8910细胞与为未转染细胞组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
3.48小时后结果显示转染重组质粒sipolβ细胞的增殖速度较未转染细胞及转染空载体的细胞明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)。而转染空载体组与正常细胞组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
4.顺铂浓度为2.5-40μg／ml时,转染pRNAT-U6.1-sipolβ组的活细胞数明显少于转染pRNAT-U6.1细胞组和正常细胞组。经统计学处理差异具有高度显著性(P<0.01),随着药物浓度的增加,差别越来越明显,且呈浓度依赖性。
结论:
1.转染质粒pRNAT-U6.1-sipolβ细胞组、pRNAT-U6.1转染细胞组及未转染细胞组经RT-PCR检测后,表达载体转染卵巢癌细胞后能显著降低细胞polβ mRNA表达。
2.转染质粒pRNAT-U6.1-sipolβ后的细胞比对照组及未转染细胞的生长速度减慢、增殖活性降低。
3.表达载体成功转染卵巢癌细胞后,细胞对顺铂的敏感性明显提高。