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背景和目标随着肝癌研究的不断深入，肝脏局部微环境在肝癌发生、发展中的作用逐渐引起人们的重视。已经证实联合应用IL-2和IL-12有很好的抗肿瘤效果，但是目前为止，两者联合的可调控质粒对肿瘤微环境的研究还未见报导。本实验首先建立小鼠原位移植性肝癌模型，将可调控的IL-2和IL-12基因联合，通过水流动力学注射的方法把质粒注入小鼠体内，这种可调控的质粒通过诱导剂能够控制转基因的表达，观察两者联合后通过改变肝脏肿瘤或脾脏局部微环境，从而抑制或延缓肿瘤的生长。方法首先建立小鼠原位移植性肝癌模型，将小鼠分成5组，3个实验组包括IL-2、IL-12和两者联合组，2个对照组包括LacZ和生理盐水组，表达mIL-2和mIL-12的质粒含有RU486调控系统和肝脏特异性启动子，通过水流动力学注射的方法把质粒注入小鼠体内，RU486进行诱导。诱导后取血，应用ELISA方法检测血清中mIL-2和mIL-12的表达水平。于诱导结束后处死部分小鼠，测量肿瘤大小。应用酶消化法和Percoll密度梯度法分离肝脏肿瘤和脾脏的淋巴细胞，借助流式细胞仪检测肝脏肿瘤和脾脏各种免疫细胞的比例。肝脏HE染色后观察组织形态学变化，免疫组织化学染色观察肿瘤组织PCNA和VEGF的表达情况，余下小鼠用于观察生存期。结果1.肿瘤大小和小鼠生存期各组小鼠的肿瘤体积为，生理盐水组（555.96±122.36）mm3、LacZ组（554.63±133.08）mm3、IL-2组（276.68±16.46）mm3、IL-12组（148.32±28.17）mm3、联合组（60.59±27.06）mm3。三个实验组肝脏肿瘤体积均低于对照组，特别是联合组，肿瘤大小明显低于对照组、IL-2组和IL-12组。各组小鼠的平均生存天数为，生理盐水组（24.75±0.86）d、LacZ组（24.89±0.98）d、IL-2组（25.00±1.74）d、IL-12组（38.00±2.94）d、联合组（40.11±6.09）。其中IL-12组与联合组均高于对照组，但是IL-12组与联合组之间没有差异。2.肝脏和肿瘤组织形态学变化肝脏HE染色可见对照组小鼠肝脏肿瘤面积较大，尽管肿瘤组织中央可见坏死组织，但是周边的瘤细胞却生长旺盛，异型性明显，瘤结节边界不清楚，瘤细胞呈浸润性生长，汇管区周围很少有单个核细胞浸润灶。而IL-2、IL-12和联合三个实验组，肿瘤面积较小，而且肿瘤基本局限于肝叶的边缘，呈局灶状分布。瘤组织与正常肝脏组织交界处整齐，肿瘤细胞层变窄，在联合组有的肿瘤细胞消失，而变成单个核细胞浸润灶。三个实验组汇管区均有大量的单个核细胞浸润灶。PCNA和VEGF免疫组织化学染色显示，对照组均有较高的阳性表达率，且阳性细胞大部分为深棕色，而三个实验组阳性细胞率较低，阳性细胞大部分为浅棕色，与对照组有统计学差异，特别是联合组阳性细胞率低于单独IL-2和IL-12组。3.血清中细胞因子的表达从mIL-2的表达来看，只有IL-2和联合组可检测到mIL-2的表达，其中IL-2组表达水平较高，联合组仅为IL-2组的58.65%。从mIL-12的表达来看，只有IL-12组和联合组可检测到mIL-12的表达，其中联合组表达水平较高，IL-12组仅为联合组的76.38%。4.肝脏肿瘤局部和脾脏免疫微环境的变化在肝脏肿瘤中，CD4+/CD8+的比值在三个实验组均低于对照组，而联合组较单独IL-2和IL-12组下降更明显。CD8+/Treg的比值在三个实验组较对照组明显增加，特别是联合组超过单独IL-2和IL-12组，增加尤其明显。在脾脏中，CD4+/CD8+的比值和CD8+/Treg的比值各组间没有统计学差异。结论1.可调控的IL-2和IL-12基因联合应用，抑制肿瘤细胞的增殖及VEGF的表达，从而延缓了肿瘤的生长。2.可调控的IL-2和IL-12基因联合降低肿瘤内CD4+/CD8+的比值，增加CD8+/Treg的比值，可以改善局部肿瘤微环境。