目的:髓样分化蛋白-2(MD-2)是最近些年发现的分泌型糖蛋白，其在结构上具有两个相对独立的功能结构域，促使它能直接与脂多糖(LPS)结合。MD-2作为天然免疫识别过程的重要调控分子，可能成为炎症性疾病治疗的新靶点。视网膜缺血再灌注损伤与TLR4/MD-2信号通路释放的炎症因子紧密相连。本课题既筛选出高效、特异靶向性MD-2小分子抑制剂后，建立稳定的以MD-2蛋白为靶点的小分子抑制剂筛选体系。同时探讨TLR4-MD-2在视网膜缺血再灌注中氧化和炎症损伤的分子机理。明确MD-2在TBHP引起的氧化和炎症中的重要作用。　　方法:　　1.重组人髓样分化蛋白(MD-2)制备获得和鉴定　　将测序鉴定序列正确的MD-2重组质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，利用卡那霉素抗性筛选出转化子。用IPTG分别诱导表达重组蛋白，得出最佳的表达条件，确定蛋白表达形式。确定蛋白以包涵体形式表达后，梯度尿素溶液透析复性，Ni亲和层析法分离纯化蛋白。250mM咪唑洗脱目的蛋白后，将目的蛋白除盐浓缩，分装冻存备用。并将重组MD-2蛋白western bloting鉴定。　　2.重组MD-2活性检测和建立化合物靶点确定　　通过ELISA实验来验证重组MD-2的活性。通过测定吸光度OD值计算LPS与MD-2结合率。利用蛋白质荧光探针Bis-ANS能与MD-2疏水区结合后产生荧光，计算吸光度OD值判别重组MD-2活性。以上两个实验来验证重组蛋白的活性之后，将重组蛋白预先与化合物先孵育，再将蛋白与化合物的复合物与LPS结合，重复上述Elisa和Bis-ANS荧光结合实验，筛选出有效化合物L2H17。最后在细胞层面上，利用流式细胞仪检测细胞表面荧光的方法，确定化合物L2H17药效。证明化合物能竞争性与MD-2结合。　　3.MD-2抑制剂保护视网膜缺血再灌注损伤体内体外机制　　在RIR模型中，检测再灌注1，3，7天后，视网膜形态和功能变化，阐述L2H17体内疗效。其次，对RIR模型后，视网膜CD68免疫组化染色和TUNEL凋亡检测，研究L2H17体内作用机制。细胞层面上，以TBHP在RPE细胞内模拟氧化损伤过程。首先检测了L2H17对RPE细胞增殖的影响。其次通过Hoechst和流式凋亡实验检测L2H17的抗凋亡作用。此后，通过测定细胞SOD和ROS含量，阐述L2H17抗氧化作用，再者用QPCR和Elisa检测了促炎因子的释放，阐述L2H17在炎症上作用。接下来，通过Western Bloting检测了L2H17对TBHP诱导的TLR4信号通路的影响。免疫共沉淀法验证MD-2是否参与TBHP诱导的TLR4的激活。最后，用siRNA沉默细胞内MD-2，验证MD-2其中作用。　　结果:　　1.重组MD-2蛋白成功获得　　250mm咪唑洗脱后，SDS凝胶电泳结果显示，经亲和纯化后目的蛋白的纯度达到70-80％以上。　　2.重组MD-2鉴定正确且具有生物学活性，建立了稳定可靠的化合物筛选体系　　重组MD-2蛋白western bloting鉴定结果得阳性。Elisa结果显示结果重组蛋白具有生物学活性，化合物L2H17能够与MD-2蛋白结合，以此竞争性阻断了MD-2与LPS的结合。与此结果一致，荧光结合实验表明重组MD-2蛋白与10μM bis-ANS共孵育后，与空白组相比，480nm荧光值也上升至200-300。并随着L2H17浓度的增加，480nm荧光值也逐渐在减弱，这表明化合物L2H17能够特异性地与MD-2蛋白相结合。流式结果显示而且随着L2H17浓度增加，荧光强度逐渐减弱，表示L2H17竞争性阻断了细胞表面MD-2与LPS的结合。这表明我们的化合物L2HI7是特异性MD-2抑制剂。　　3.MD-2抑制剂保护视网膜缺血再灌注损伤　　体内实验中，RIR造成视网膜RGCs层细胞数目减少，结构紊乱，而且INL层厚度不正常，L2H17给药组能明显增加RGCs层细胞数目，使INL层厚度恢复正常。在视网膜功能上，L2H17也能起到明显恢复作用。体外细胞实验中，L2H17能通过抑制细胞凋亡，而表现出细胞增殖。能增加细胞内SOD活性，减少ROS的产生，并且抑制TBHP诱导引起的促炎因子的释放。TBHP刺激后，能激活细胞内TLR4-NF-κB信号通路，而L2H17能不仅能抑制TLR4以及下游的MAPK蛋白，还能抑制NF-κB的激活，减少凋亡相关蛋白Bax，Caspase-3的表达。IP实验证明MD-2参与TBHP诱导的TLR4的激活。SiRNA结果与L2H17结果一致。　　结论:　　1.成功表达纯化MD-2蛋白，但仍可以优化纯化条件，得到更高活性和纯度的重组蛋白。　　2.Elisa结合实验，荧光结合实验和LPS-FITC结合实验证明L2H17是MD-2特异抑制剂，证明这三种方法的筛选体系的可行性。　　3.成功构建视网膜缺血再灌注模型。L2H17能缓解视网膜缺血再灌注引起的炎症浸润和视网膜细胞的凋亡，对视网膜缺血再灌注损伤有明显的治疗作用。L2H17化合物具有良好的抗炎抗氧化作用。L2H17能够通过特异性抑制MD-2这个靶点，抑制TBHP引起的细胞凋亡，保护TBHP引起氧化和炎症损伤。　　4.MD-2参与TBHP诱导的氧化过程，以此为靶点的小分子抑制剂有应用前景。