背景:肾细胞癌（RCC）是泌尿外科最常见及最致命的恶性肿瘤之一,约占全球所有诊断癌症的5%,随着人们生活方式的改变及医疗检测技术的进步,预计未来RCC的发病率和检出率还会继续上升。RCC在早期行根治性手术大都能获得不错的预后,但很不幸的是,由于RCC隐匿发病的特点,大部分患者在初诊时已经处于晚期,肿瘤已经发生扩散或转移。因此亟需发现新的有效的生物标志物或分子靶点以早期发现RCC从而及时阻止其恶性进展,进而改善RCC患者的生存预后。非编码RNA（non-coding RNAs,nc RNAs）在调控基因表达上扮演着重要角色,它们与m RNAs之间的相互调控形成复杂的基因表达调控网络称为竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNA,ce RNA）网络。微小RNA（mi RNA）和长链非编码RNA（Lnc RNA）均为nc RNAs的亚型,mi RNAs主要通过与靶分子的3’-非翻译区（3’UTR）结合达到沉默或抑制靶分子表达的目的;Lnc RNA是一种长度超过200nt的nc RNA,不同的Lnc RNAs可分别在表观遗传、转录和转录后水平调控基因表达。许多Lnc RNAs包含可与mi RNAs结合的mi RNAs响应元件（MREs）,正是因为这个特点,一些Lnc RNAs可在转录后水平通过MREs竞争性地结合mi RNAs,从而进一步调控靶基因表达和复杂的生物学过程。研究已经证明Lnc RNA与RCC癌变的发生和恶性进展密切相关,由Lnc RNA等非编码RNA形成的ce RNA网络是RCC发生、发展的重要调控网络。本课题先利用RCC组织标本测序筛出Lnc RNA DLEU2分子,然后用生物信息学分析方法分析了DLEU2在RCC组织、细胞系中的表达,DLEU2与RCC病理分期、分级等临床特征的关系,DLEU2与RCC免疫浸润的关系,DLEU2诊断RCC的准确度,DLEU2与RCC患者生存预后的关系,以及基于DLEU2在RCC中的表达水平构建的列线图模型预测RCC患者生存预后的可靠性。接下来我们进行了细胞实验验证,首先,我们采用q RT-PCR实验验证了DLEU2在RCC组织和细胞中高表达,然后利用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）转染技术将si RNA转入RCC细胞系中以成功干扰DLEU2的表达,接下来行体外细胞功能实验检测干扰DLEU2表达后对RCC细胞功能表型的影响。上皮间质化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是癌症浸润、转移过程中一种重要的细胞形态学改变,它的发生与肿瘤细胞的迁移和侵袭行为密切相关,基于这我们用免疫印迹（western blot,WB）检测了改变DLEU2表达后EMT相关的标志物蛋白水平的改变,随后我们利用慢病毒转染技术构建好可稳定干扰DLEU2表达的RCC细胞株,行裸鼠皮下成瘤实验,在体内水平再次观察DLEU2的表达改变对RCC生长的影响。为进一步探索DLEU2影响RCC恶性进展的分子机制,我们对DLEU2进行了细胞亚定位分析,观测到其主要分布在RCC细胞胞质,推测其可能作为Ce RNA发挥作用,随后我们在公共数据库网站预测到可与DLEU2靶向结合的mi R-582-5p分子和mi R-582-5p分子的靶基因ZEB2。我们利用si RNA转染、q RT-PCR和WB技术检测了三者之间表达的相关性,然后我们用双荧光素酶报告基因实验证明了DLEU2与mi R-582-5p以及mi R-582-5p与ZEB2之间的直接结合关系,最后我们进行了体外细胞功能实验（包括挽救实验）,最终我们发现DLEU2可通过mi R-582-5p/ZEB2介导RCC的恶性进展。本研究主要囊括三部分内容,第一部分为长链非编码RNA DLEU2的筛选和初步验证,第二部分为DLEU2可促进RCC增殖、迁移、侵袭和EMT的发生,第三部分为DLEU2通过mi R-582-5p/ZEB2信号轴调控RCC的恶性进展。第一部分:长链非编码RNA DLEU2的筛选和初步验证方法:（1）通过对我们课题组前期收集的三对配对的RCC组织标本转录组测序结果分析筛选获得在RCC中差异表达的Lnc RNAs.（2）利用生物信息学方法分析选中的目的Lnc RNA DLEU2在人类泛癌、RCC组织配对样本和RCC细胞系中的表达水平,DLEU2的表达与RCC分期、分级等临床病理特征之间的关系,DLEU2与RCC免疫浸润之间的关系,DLEU2预测RCC的敏感度,DLEU2表达水平与RCC患者生存预后之间的关系以及基于DLEU2的表达水平构建的列线图模型预测RCC患者的生存预后的价值。（3）q RT-PCR实验验证目的Lnc RNA DLEU2在RCC组织和各细胞系中的表达水平。（4）核质分离技术结合q RT-PCR实验检测DLEU2在RCC细胞中亚定位为下一步分析其作用机制作准备。结果:（1）按fold change＞1.0,p Values＜0.05这一标准筛选,同时借助公共数据库平台,我们选定DLEU2作为我们本研究的目的Lnc RNA。（2）DLEU2在人类大部分癌症中显著上调,包括RCC,其表达水平与RCC的T.N.M分期密切相关,与RCC免疫浸润有一定相关性,并且在诊断RCC上有一定的准确性,此外DLEU2与RCC患者的生存预后密切相关,且在预测RCC患者的生存预后方面具有一定的价值。（3）DLEU2在RCC组织和细胞系中的表达水平显著高于在RCC癌旁的正常组织和正常肾脏近曲小管细胞中的表达水平。（4）核质分离和q RT-PCR实验结果显示DLEU2在RCC细胞中胞核和胞质均有分布,但主要分布于细胞质。结论:RCC组织标本的RNA-seq结果和生物信息学分析结果显示Lnc RNA DLEU2在RCC中表达上调,且其表达与RCC病理分期、免疫浸润和生存预后显著相关,并且在诊断RCC和预测RCC的生存预后方面具有一定的价值,该分子主要分布在RCC细胞的胞质中。第二部分:DLEU2可促进RCC增殖、迁移、侵袭和EMT的发生方法:（1）CCK8实验及细胞平板克隆实验检测抑制DLEU2表达后RCC细胞增殖能力的变化。（2）细胞划痕实验检测干扰DLEU2表达后RCC细胞的迁移能力的变化。（3）Transwell实验检测干扰DLEU2表达后RCC细胞迁移和侵袭能力的变化。（4）WB技术检测抑制DLEU2表达后与EMT相关的标志物蛋白的变化。（5）构建可长期稳定干扰DLEU2表达的慢病毒稳转株细胞A498,然后行裸鼠皮下成瘤实验检测抑制DLEU2表达后对裸鼠体内肿瘤生长的影响。结果:（1）CCK8实验和细胞平板克隆实验显示抑制DLEU2表达后,RCC细胞的增殖能力明显下降。（2）细胞划痕实验显示抑制DLEU2表达后,划痕的愈合能力显著下降。（3）Transwell实验显示抑制DLEU2表达后,RCC细胞的迁移和侵袭能力均明显下降。（4）WB结果显示下调DLEU2后,EMT相关的标志物蛋白的表达发生显著变化,其中E-cadherin表达上调,N-cadherin和Vimentin表达下调,这证明了DLEU2可促进RCC的EMT发生。（5）裸鼠皮下成瘤实验显示抑制DLEU2表达后,体内瘤体的生长也显著受到抑制。结论:DLEU2在体外可促进RCC细胞的增殖,迁移和侵袭,在体内可促进肿瘤的生长。表明DLEU2是RCC的一个促癌因子。第三部分:DLEU2通过mi R-582-5p/ZEB2信号轴调控RCC的恶性进展方法:（1）公共数据库starbase预测DLEU2的下游基因,q RT-PCR和WB实验在RNA水平和蛋白质水平检测改变DLEU2表达水平后所预测的下游基因表达是否变化（2）公共数据库starbase、Target Scan预测同时靶向DLEU2和其下游基因ZEB2的mi RNAs,韦恩图取交集找到目标mi RNA分子mi R-582-5p。（3）q PCR、WB验证mi R-582-5p是否可同时调控DLEU2和ZEB2。（4）双荧光素酶报告基因实验再次验证mi R-582-5p是否可直接靶向DLEU2和ZEB2。（5）q RT-PCR实验检测mi R-582-5p在RCC组织和RCC细胞系中的表达情况。（6）挽救实验检测DLEU2是否通过mi R-582-5p/ZEB2信号轴促进RCC的进展。结果:（1）ZEB2分子是受DLEU2调控的一个下游基因。（2）数据库starbase、Target Scan中的结果显示mi R-582-5p与DLEU2、mi R-582-5p与ZEB2均有结合位点。（3）敲低DLEU2表达后mi R-582-5p表达上调,过表达mi R-582-5p后ZEB2表达下降（4）双荧光素酶报告基因实验显示mi R-582-5p与DLEU2、mi R-582-5p与ZEB2均有直接结合位点。（5）mi R-582-5p在RCC组织和细胞系中的表达水平相较于正常的对照组织和细胞系为低表达。（6）挽救实验显示抑制mi R-582-5p表达可以部分解除干扰DLEU2的表达对RCC细胞功能表型的影响。结论:DLEU2可通过mi R-582-5p/ZEB2信号轴介导RCC的恶性进展。