目的:脑水肿通常指脑内含水量的增加,主要是由于血脑屏障的破损(血管源性脑水肿)和外源溶液的流入以及神经细胞肿胀(细胞毒性脑水肿)所致。其中,细胞毒性脑水肿来源于大量星形胶质细胞的体积膨胀。细胞内渗透物质浓度增加时,能导致细胞脂质双分子层承受增大的渗透势能,通过牵拉与细胞膜相连的细胞骨架结构,诱导细胞体积的膨胀进而导致神经细胞的形态和结构改变。同时,胞膜的拉伸也能激活机械敏感离子通道,导致离子如Ca2+等流入,通过调节动力蛋白分子,导致微丝和微管张力的变化。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞中的主要中间丝蛋白。渗透压力、微丝和微管张力协同作用细胞骨架中间丝,诱导细胞结构和形态变化。本研究课题通过检测细胞水肿过程中胞内微丝、微管结构张力、中间纤维胶质纤维酸性蛋白张力和细胞质溶液渗透压的变化,识别调控神经细胞水肿的力学调控机制,从而揭示细胞毒性脑水肿与神经细胞内力学活动相关的分子机制。应用微丝、微管解聚因子上游蛋白Slingshot(SSH)和Protein phosphatasa 2A(PP2A)的中药单体抑制剂番泻苷A和斑蝥素以及钙离子抑制剂联合临床治疗药物来降低细胞内张力,治疗脑水肿。方法:基于荧光共振能量转移原理(FRET)和分子克隆技术,将供体Cerulean和受体Venus荧光蛋白连接,构建成cpstFRET角度张力探针,将力学变化转换成光学信号,同时分别嵌入肌动蛋白、微管蛋白和胶质纤维酸性蛋白之间,构建成AcpA,TcpT和GcpG荧光张力探针,并转入U87和原代星形胶质细胞,诱导其表达,用于细胞内结构张力检测。本实验(1)应用谷氨酸刺激模拟神经细胞毒性水肿模型;(2)采用激光共聚焦技术分析张力探针的有效性,检测细胞结构张力在神经细胞水肿模型中的变化及其相互的力学作用;(3)利用微丝微管解聚剂及其动力分子抑制剂评价微丝和微管张力对胶质纤维酸性蛋白牵拉力的矢量关系;(4)通过检测离子和胶体渗透压、细胞质溶液纳米颗粒分布情况,研究细胞内离子和蛋白质纳米颗粒诱导的渗透压对骨架结构张力的影响;(5)使用骨架蛋白稳定剂、中药单体、离子通道抑制剂和临床氧自由基清除剂等,研究结构张力改变与细胞毒性脑水肿的联系,以及结构张力改变对脑水肿的影响;(6)建立SD大鼠细胞毒性脑水肿模型,利用苏木精-伊红染色实验阐明联合药物在谷氨酸诱导下的力学调控机制。结果:构建的AcpA,TcpT和GcpG荧光张力探针能有效检测细胞内微丝、微管张力和胶质纤维酸性蛋白牵拉力的变化,并且GcpG荧光张力探针可用于细胞外应激刺激下细胞肿胀的力学变化检测。通过张力探针,我们发现胞内渗透压力,微丝和微管力参与了GFAP张力的调节。同时,在谷氨酸诱导的星形胶质细胞肿胀模型中发现GFAP张力参与细胞肿胀,且稳定微丝和微管对谷氨酸所致星形胶质细胞肿胀有一定的拮抗作用。谷氨酸刺激可通过激活Cofilin和Stathmin-1导致微丝和微管的解聚,其上游钙信号、SSH和PP2A的激活也参与了谷氨酸诱导的细胞毒性水肿过程中微丝或微管的解聚。谷氨酸诱导的星形胶质细胞骨架解聚可导致胞内蛋白质纳米颗粒的生成,进而生成蛋白质纳米颗粒相关渗透压诱导胞内渗透势能增加。所以联合应用钙离子通道抑制剂尼莫地平、神经保护剂依达拉奉和马来酸桂哌齐特,以及微丝和微管解聚因子抑制剂的中药单体番泻苷A和斑蝥素,可以有效地减弱GFAP张力,从而降低细胞体积肿胀。结论:本研究关注于星形胶质细胞肿胀过程中细胞内微丝、微管和中间纤维结构张力的矢量关系,特别是蛋白质纳米颗粒诱导的渗透压力。离子渗透压和蛋白纳米颗粒诱导的渗透压协同调节了中间纤维的向外牵拉张力。细胞质势能的恢复对新药开发和脑水肿治疗具有潜在的价值。本研究对星形胶质细胞肿胀的进展提供了更深刻的认识,并为治疗方法提供了新的思路。