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茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum)是世界上最重要的植物病原细菌之一,寄主范围广泛,可侵染50科450余种寄主植物。该病原菌在保存过程中易发生自然突变丧失致病力,但其机理还不清楚。本论文以分离自沙姜的茄科青枯菌自然致病力丧失突变体YC40-M作为研究对象,测定了突变体基因组全序列、筛选出突变基因、分析了5个致病相关候选基因功能,旨在揭示茄科青枯菌自然致病力丧失的分子机理,为青枯病防控技术研究提供理论依据。主要研究结果如下:1.以茄科青枯菌GMI1000基因组作为参考,对沙姜青枯菌株YC40的自然致病力丧失突变菌株YC40-M及其野生型YC40-W进行基因组重测序分析,SNP位点统计结果显示,YC40-M有45745个SNP位点,其中同义突变19443个,非同义突变18006个;YC40-W有45745位点,其中同义突变19689个,非同义突变18039个。InDel位点统计结果表明,YC40-M有1312个InDel位点,其中移码突变基因323个,非移码突变基因210个;而YC40-W有1291个InDel位点,其中移码突变基因314个,非移码突变基因208个。YC40-M与YC40-W差异位点1518个,非同义突变基因102个,包括碱基置换突变基因67个,移码突变基因35个。2.应用二代高通量Illumina Miseq和第三代PacBio测序技术,对YC40-M基因组全序列进行测定,其基因组全长为5.75Mb,包含5399个基因,4个rRNA操纵子,57个tRNA,其中染色体大小为3,844,764 bp(GenBank no.CP015850),编码3716个基因;宏质粒大小为1,907,366 bp(GenBank no.CP015851),编码1683个基因。染色体的基因中有3081个可以归属于COG家族,宏质粒基因中有770个可以归属于COG家族,还有224个基因在数据库中没有任何匹配。3.基因敲除构建YC40-W PhcA基因突变体YC40ΔPhcA。生物学测定显示,YC40ΔPhcA表型发生转换,生物膜增多,运动性增强,生长速率降低,生长增殖稳定期延长,对沙姜、番茄和辣椒的致病力较野生型菌株明显下降,验证了PhcA基因是参与青枯菌表型转换的关键基因。自然突变株YC40-M与YC40ΔPhc A相比,无致病力、无运动性、不引起烟草HR反应及在Boucher培养基中基本不生长。因此,Phc A参与青枯菌致病,而YC40-M与YC40ΔPhcA存在差异,说明青枯菌的自然致病力丧失除PhcA基因外还有其他基因参与。4.ParA2基因是细胞过程一种编码基因,ParA2基因敲除与功能分析表明,YC40-W ParA2基因突变体菌落明显变小,生长缓慢,胞外多糖分泌显著减少,无流动性,生物膜形成量减少,在NA培养基和Boucher基础培养基中生长速率均降低;突变体对沙姜的致病力明显降低。因此,ParA2基因对青枯菌的生长、胞外多糖分泌及其致病有重要作用。5.将YC40-W的RSp801、RSp931和RSc2202基因分别替换为YC40-M相应的突变基因片段,分别构建3个基因的突变体,其中RSp801基因突变体胞外多糖分泌增加,流动性增大,菌落直径变大,生物膜减少,在Boucher基础培养基中生长速率降低;RSp931基因突变体表型无明显变化,生物膜产量减少,在Boucher基础培养基中生长速率降低;RSc2202基因突变体胞外多糖分泌减少,流动性减弱,菌落直径变小,生物膜产量显著降低,在Boucher基础培养基中生长速率降低。接种寄主沙姜结果表明,RSc2202基因突变体接种处理的病株率比YC40-W低50%,说明其致病力下降;RSp801和RSp931基因突变体接种处理的病株率与YC40-W相同,但前者病情发展加快,后者病情减缓,说明前者致病力较野生型增强,而后者致病力下降。因此,RSp801、RSp931和RSc2202基因与青枯菌的致病力相关。