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目的牙周炎是由牙菌斑中微生物导致牙周支持组织引发的慢性感染性疾病,发病后能够打破牙槽骨吸收和修复的动态平衡,引起牙槽骨的吸收大于牙槽骨的修复,进而造成牙槽骨高度的降低。牙周病治疗的目的已经远远不是单纯的控制炎症,更是将已经破坏的牙周组织让其再生并形成新的附着。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周膜组织中的定向干细胞,和其他干细胞一样具有多向分化的潜能,在牙周组织的损伤修复过程中发挥重要的作用。研究表明PDLSCs可高表达I型/III型胶原等细胞外基质(extracellular matrix,ECM)并分泌至胞外,此外PDLSCs可经诱导发生成骨分化促进牙槽骨的再生,是牙槽骨修复的细胞学基础。降钙素家族成员可通过结合同一类降钙素受体进而激活胞内信号途径影响不同细胞的生物学性质。现有研究结果证实降钙素(calcitonin,CT)在骨愈合过程中的作用机制为促进成骨细胞增殖、分泌和合成细胞外基质并促进基质钙化及促进成骨细胞转化为骨细胞,还可通过促进OPG表达,降低RANKL表达,抑制破骨细胞的生成。但迄今为止,对CT调控PDLSCs成骨分化的作用机制,及其在牙槽骨再生过程中的作用尚未见报道。本研究探讨CT对PDLSCs胶原合成和成骨分化的作用及可能的分子机制。方法(一)临床选取60名患者,分为两组:慢性牙周炎组和健康对照组。记录牙龈指数、探诊深度、临床附着水平。采集龈沟液,运用定量酶联免疫吸附法(ELISA)检测龈沟液内CT,TGF-β1,BMPs的含量,比较正常人及牙周炎患者龈沟液中CT,TGF-β1,BMPs的表达水平,统计分析CT与TGF-β1,BMPs表达水平的相关性,以及CT表达与慢性牙周炎患者临床指标的相关性。(二)采集因正畸拔除的前磨牙,采用酶消化联合组织贴附法,行原代培养获得人牙周膜细胞。进而利用免疫磁珠技术对STRO1阳性牙周膜细胞进行分选,获得PDLSCs。通过克隆形成实验检测PDLSCs的克隆形成能力。通过诱导培养基培养,分别通过von kossa染色、油红O染色和番红花精O染色检测PDLSCs的多向分化能力。构建含ct基因阅读框的重组腺病毒ad.ct,感染人pdlscs。通过定量pcr和westernblot的方法,检测人pdlscs中i型/iii型胶原,以及成骨分化标志蛋白alp和ocn的表达水平。探讨表达ct对人pdlscs胶原分泌及成骨分化的的作用。(三)ad.ct感染人pdlscs,通过定量pcr和western-blot测定tgf-β1表达水平,观察过表达ct对人pdlscs中tgf-β1表达水平的影响。合成特异性针对tgf-β1的sirna片段。ad.ct感染人pdlscs同时转染tgf-β1sirna特异性抑制人pdlscs中tgf-β1的表达。通过定量pcr测定和western-blot测定的方法,检测人pdlscs中i型/iii型胶原的表达水平。探讨ct是否通过调控tgf-β1表达的途径进而影响pdlscs的胶原蛋白合成。(四)ad.ct感染人pdlscs,通过定量pcr和western-blot测定bmps表达水平,观察过表达ct对人pdlscs中bmps表达水平的影响。ad.ct感染人pdlscs同时给予bmps途径特异性抑制剂noggin处理。通过定量pcr测定和western-blot测定的方法,检测人pdlscs中成骨分化相关标志ocn/alp的表达水平。探讨ct是否通过调控bmps表达的途径进而影响pdlscs的成骨分化。结果(一)慢性牙周炎患者龈沟液中ct,tgf-β1,bmp2/4/7的表达水平显著高于正常对照。统计分析结果显示,慢性牙周炎患者中ct表达水平与tgf-β1以及bmp2/4/7表达水平呈正相关。ct的表达水平患者的牙龈指数、探诊深度、临床附着水平负相关,与患者的年龄、性别无相关性。(二)成功培养获得人原代牙周膜细胞,通过免疫磁珠分选获得stro1阳性牙周膜干细胞。流式细胞仪检测显示,分选后细胞中stro1+/cd146+细胞比例为96.2%。细胞克隆形成实验结果显示分选获得的stro1+/cd146+细胞克隆形成率为65.7±9.1%,显著高于未分选的牙周膜细胞(27.1±5.2%,p<0.01)。pdlscs成骨诱导培养后,vonkossa染色出现矿化结节。pdlscs成脂诱导培养后,油红o染色可见脂滴。pdlscs成软骨诱导培养后,番红花精o染色阳性。ad.ct感染人pdlscs48hr后,检测发现i型/iii型胶原ocn/alp的mrna及蛋白表达水平均显著升高。(三)Ad.CT感染人PDLSCs 48hr后,检测发现TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高。Ad.TGF-β1siRNA转染人PDLSCs 48hr后,可显著抑制TGF-β1 mRNA及蛋白表达。Ad.CT/TGF-β1siRNA共同处理人PDLSCs后,I型/III型胶原的表达水平较Ad.CT单独处理显著降低。(四)Ad.CT感染人PDLSCs 48hr后,检测发现BMP2/4 m RNA及蛋白表达水平均显著升高,但BMP7表达水平未见显著变化。Noggin处理人PDLSCs 48hr后,可显著抑制BMPs活性。Ad.CT/Noggin共同处理人PDLSCs后,OCN/ALP的表达水平较Ad.CT单独处理显著降低。结论(一)CT在牙周炎患者龈沟液中高表达且与患者的牙龈指数、探诊深度、临床附着水平呈负相关,提示CT参与了牙周炎的发生发展,高表达CT可能是牙周炎发病的保护因素,其作用可能与调控牙周组织损伤修复有关。龈沟液中CT表达水平与TGF-β1以及BMP2/4/7表达水平正相关,提示CT可能通过调控TGF-β1及BMPs信号通路促进牙周组织损伤修复。(二)原代培养的人STRO1+牙周膜细胞成克隆能力显著高于牙周膜细胞,此外STRO1+牙周膜细胞具有体外多向诱导分化能力,提示人STRO1+牙周膜细胞具有人PDLSCs性质。过表达CT可显著提高人PDLSCs中I型/III型胶原及OCN/ALP的表达水平,提示CT具有促进人PDLSCs纤维化及成骨分化的作用。(三)过表达CT可显著提高人PDLSCs中TGF-β1的表达水平。抑制TGF-β1表达可显著抑制过表达CT对人PDLSCs I型/III型胶原表达的促进作用,提示CT可能通过上调TGF-β1表达的途径促进PDLSCs纤维化。(四)过表达CT可显著提高人PDLSCs中BMP2/4的表达水平。抑制BMPs活性可显著抑制过表达CT对人PDLSCs OCN/ALP表达的促进作用,提示CT可能通过上调BMP2/4表达的途径促进PDLSCs成骨分化。