研究目的:细胞周期中CDK2分子的异常激活可以引起多数肿瘤细胞持续增殖,因此,探讨CDK2分子的调节,有助于了解疾病发生的本质。本研究旨在证实血清饥饿对CDK2蛋白下调的作用、评估其诱导的下调是否需要PI3K/AKT通路的参与,并探究CDK2蛋白通过自噬-溶酶体降解的分子机制。研究方法:1.应用流式细胞术检测细胞饥饿处理时的细胞周期变化;采用蛋白质免疫印迹法检测饥饿状态下神经母细胞瘤细胞和结直肠癌细胞的RB磷酸化水平以及CDK2蛋白;通过实时荧光定量PCR技术检测血清饥饿处理的细胞CDK2分子的mRNA水平。2.运用蛋白质免疫印迹法检测饥饿处理时PI3K/AKT信号通路的分子水平,饥饿处理PIK3CA突变的结直肠癌细胞以及PI3K抑制剂、AKT抑制剂、mTOR抑制剂、蛋白质合成抑制剂CHX处理神经母细胞瘤细胞时CDK2蛋白的表达情况。3.采用蛋白质免疫印迹法检测饥饿状态下加入蛋白酶抑制剂、自噬抑制剂和溶酶体抑制剂处理细胞后的CDK2蛋白的表达以及饥饿处理时自噬调节蛋白P62的表达;构建ATG7和Beclin-1自噬基因敲除的稳转细胞系,并检测饥饿、PI3K抑制剂、AKT抑制剂处理后的CDK2、P62蛋白的水平;通过免疫共沉淀技术,检测P62和CDK2蛋白的相互作用;在神经母细胞瘤内转染P62、Cathepsin D、Cathepsin B的siRNA干扰序列基础上,饥饿处理的CDK2蛋白水平;通过免疫荧光技术检测CDK2蛋白的亚细胞定位。研究结果:1.血清饥饿诱导细胞周期的G0/G1期阻滞伴随CDK2蛋白下调。2.PI3Kα/AKT ^T308的抑制参与CDK2蛋白的下调。3.自噬-溶酶体抑制剂能明显恢复PI3Kα/AKT ^T308受抑制后下调的CDK2蛋白,阻断自噬基因能显著恢复CDK2蛋白,并且PI3K/AKT ^T308受抑制后通过P62介导CDK2蛋白以自噬-溶酶体途径降解。研究结论:抑制PI3Kα/AKT ^T308通过P62/SQSTM1介导CDK2蛋白以CTSB依赖的自噬-溶酶体途径降解CDK2蛋白,进而引起肿瘤细胞G0/G1期阻滞。