能量代谢是动物生长、生产、繁育等重要生命活动的基础;同时与人类代谢综合症等息息相关。因此,对能量代谢调控进行研究不仅有助于提高动物生产经济效益同时对于改善人类健康也具有重大的意义。在本课题组前期的研究中,通过对大白猪的组织表达谱分析,发现GPR120是差异表达基因。GPR120基因参与能量平衡的多个生理过程,调节全身性能量和营养代谢平衡。本研究拟对GPR120基因进行研究,分析研究GPR120基因的转录调控机制,揭示GPR120基因在能量代谢调控过程的作用。本研究还基于胚胎期大白猪和通城猪的背最长肌组织的Solexa测序获得miR-25,通过分析miR-25序列,预测靶基因并进行功能分析验证;同时对miR-25的转录调控机制进行初步研究,探寻转录因子调节miR-25转录的分子机制。主要研究结果如下:1.猪GPR120基因的转录调控机制研究基于预测的启动子区域CpG岛分布情况构建GPR120基因启动子区域的缺失片段双荧光素酶载体,双荧光结果显示缺失片段P5(-323/+165)是GPR120基因核心启动子区域。使用TFSEARCH ver.1.3网站预测GPR120基因核心启动子区域中有与能量代谢相关的转录因子C/EBPβ的结合位点(TGTCG);而且在人、小鼠和猪三个物种,GPR120启动子区域中的C/EBPβ结合位点高度保守。通过定点突变实验证明转录因子C/EBPβ结合位点的突变显著地抑制了GPR120启动子的转录活性;而且通过ChIP实验表明,在体内环境中,转录因子C/EBPβ可以与GPR120基因核心启动子结合。超表达C/EBPβ显著性促进了GPR120和PPARγ基因的表达;而干涉C/EBPβ的表达则显著性抑制了GPR120基因的表达。此外,我们的实验结果还表明,高能饲喂(HFD-feeding)能够促进小鼠脂肪组织中GPR120,C/EBPβ和PPAR-γ2基因的表达,并且能够增强转录因子C/EBPβ与GPR120基因启动子区域的结合能力。2.miR-25在肌肉细胞能量代谢中的作用对C2C12成肌细胞进行成肌诱导分化,检测结果表明:小鼠miR-25-3p的表达量在C2C12成肌细胞分化过程中呈现先下调后上调的变化趋势。在转染miR-25-3p mimics的实验组中,检测结果表明肌肉细胞能量代谢的标志基因PI3K、Map2k4的表达水平显著下降。运用多种miRNA靶基因预测生物信息学网站预测miR-25-3p靶基因,发现Akt1基因的3’UTR区域有miR-25-3p的结合位点,而且序列比对分析发现在哺乳动物中Akt1基因的miR-25靶位点序列具有高度的保守性。双荧光结果显示,miR-25-3p显著地抑制了Akt1-3’UTR的荧光活性,说明miR-25-3p能够识别Akt1基因的3’UTR上的miR-25-3p靶位点并与其发生特异性结合。超表达miR-25-3p可以显著性下调Akt1和PI3K基因的mRNA表达水平;与此同时,miR-25-3p的超表达导致了Akt1和PI3K蛋白表达水平的下降。总之,miR-25-3p可以靶向基因Akt1,并抑制Akt1在mRNA和蛋白水平上的表达,进而可能影响PI3K/Akt信号通路的活化,调节肌肉细胞的能量代谢过程。3.小鼠miR-25转录调控机制的研究本研究中,我们克隆了小鼠miR-25-3p的5′端上游区域2034 bp序列并构建miR-25-3p启动子区域缺失片段荧光载体,荧光活性检测结果发现,缺失片段miR-25-3p-P9(-119/+144)是miR-25的核心启动子区域。使用生物信息学网站对miR-25核心启动子的转录调控元件进行预测分析,发现一个潜在的转录因子AP-2α结合位点。定点突变实验发现转录因子AP-2α结合位点的突变显著地抑制了miR-25启动子的转录活性。通过ChIP-Q-PCR实验证明:在体内环境中,转录因子AP-2α可以与miR-25启动子发生特异性地结合。而且通过ChIP-Q-PCR实验证明与C2C12细胞分化第8 d相比,转录因子AP-2α与miR-25启动子在C2C12细胞分化第0 d时结合能力更强。超表达AP-2α可以显著促进miR-25启动子的活性;而且超表达AP-2α可以显著性提高miR-25的mRNA表达量,同时也可以下调miR-25靶基因Akt1的mRNA和蛋白表达水平;与此一致,干涉AP-2α的表达显著性抑制了miR-25的mRNA表达量,同时也提高了基因Akt1的mRNA和蛋白表达量。上述实验结果证明AP-2α在miR-25转录过程中有着重要的调控作用,并且能够识别miR-25核心启动子区域的转录因子AP-2α结合位点,而且同时还发现转录因子AP-2α对miR-25靶基因Akt1的表达有抑制作用。