背景:秀丽线虫是十分经典的模式动物,自上个世纪开始就被广泛应用于生命科学研究领域,相关的研究策略、工具及数据十分齐全。作为最简单的模式动物,它有许多其他模式动物所没有的优点,如培养条件极简单、生活周期短、通体透明、体细胞数目固定甚至每个细胞都可以追溯其发生的源头。围绕秀丽线虫中仅有的Neuroligin:NLG-1的研究有助于我们理解Neuroligins和它的生物学功能。作为神经元突触上的重要组织分子,它与多种神经精神疾病相关。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的一种衍生纳米材料,由于其特殊而优异的理化性质,被广泛应用于包括药物载体、生物传感器、生物成像等许多研究与应用领域。有一定的体外及在体证据证明GO对生物体具有潜在毒性,然而其致毒的神经调控机制尚不十分明确。本研究以秀丽线虫NLG-1调控GO毒效应为切入点,探究GO毒效应的神经调控机制,同时为工程纳米材料在生物医学上使用时面对特殊人群需要考虑的问题提供相应依据。方法:对功能缺失突变体、RNA干扰敲降的秀丽线虫进行GO暴露并选取ROS水平、运动行为能力等毒性评价终点来判断特定基因是否参与了 GO毒效应。利用遗传学手段进行秀丽线虫基因过表达、恢复表达,或突变、敲降与过表达、恢复表达的组合方式进行GO毒效应评价来寻找参与GO毒效应调控的神经元,以及探索相关基因在GO毒效应调控时的上下游靶向关系。以qRT-PCR、GFP荧光分析、生物信息学分析、免疫共沉淀、免疫印迹等手段进一步确认相关分子机制。用分子探针RhoB探索GO在体转运分布情况。建立行为学模型,探索秀丽线虫对工程纳米材料感知及回避行为。结果:1.秀丽线虫中间神经元NLG-1调控氧化石墨毒烯效应分子机制利用秀丽线虫这一在体系统,证明了氧化石墨烯会导致NLG-1/Neuroligin介导的分子信号功能异常。GO暴露会导致突触后膜神经黏附因子Neuroligin表达量的下降。nlg-1功能缺失型突变会造成秀丽线虫对于GO毒性更加敏感。突变体NLG-1恢复表达实验证明,AIY中间神经元的NLG-1可以参与GO毒效应调控。秀丽线虫的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶C,PKC-1是AIY中间神经元中NLG-1调控GO毒效应的下游靶点。进一步的实验证明,秀丽线虫ERK信号通路中编码Rap蛋白的基因LIN-45是PKC-1的下游靶点参与了 GO毒效应调控。因此,GO暴露会导致中间神经元中NLG-1介导的分子信号NLG-1-PKC-1-LIN-45功能失调,而这一信号在秀丽线虫响应GO暴露过程中可能发挥重要功能。此外,肠道RNAi敲降编码FOXO转录因子daf-16基因能够抑制过表达NLG-1秀丽线虫对于GO毒性的抗性,暗示了秀丽线虫神经元中NLG-1信号通路与肠道胰岛素信号通路之间的重要关联。2.神经元中突触后膜复合物分子DLG-1及MAGI-1作为NLG-1的直接靶点参与了 GO毒效应调控:利用特异性启动子Punc-14或Pmyo-3分别恢复表达神经元或肌肉中的NLG-1于nlg-1突变体,发现NLG-1仅在神经元中发挥调控GO毒效应的功能。利用生物信息学手段找到秀丽线虫dlg-1、lin-2、magi-1、nmr-1、nmr-2为哺乳动物突触后膜复合物的同源基因,对相关突变体或敲降秀丽线虫进行GO毒性应评价。结果显示,只有dlg-1RNAi及magi-1突变体对GO毒性更加敏感。dlg-1 RNAi或magi-1突变均可以导致神经元过表达NLG-1秀丽线虫对GO毒性抗性表型的消失。经过分析预测DLG-1及MAGI-1潜在的与NLG-1直接结合的蛋白结构域位点,通过原核表达相关结构域,并在NLG-1-C端融合GST标签、靶蛋白结构域融合6 ×His标签的方式进行免疫共沉淀分析,确认了 NLG-1-C端可以结合 DLG-1-PDZ-3、MAGI-1-WW(1-2)、MAGI-1-PDZ-3。在共沉淀条件中加入暴露浓度 GO,则会直接影响 NLG-1-C 与 DLG-1-PDZ-3、MAGI-1-WW(1-2)、MAGI-1-PDZ-3的结合效率。3.筛选GO感知与毒效应调控的神经元:基于建立的行为学模型,发现野生型秀丽线虫会对GO产生回避的行为。NLG-1的两种突变体(nlg-1(ok259)及nlg-l(tm474)存在GO回避行为缺陷。在突变体的AIY或AIB神经元中恢复表达NLG-1能够恢复nlg-1(ok259)突变体GO回避行为缺陷,暗示AIY与AIB中间神经元可能参与了秀丽线虫回避GO行为的调控。结论:神经粘附因子NLG-1在GO毒效应调控中发挥了重要的功能。秀丽线虫AIY中间神经元中NLG-1-PKC-1-LIN-45信号通路参与了 GO毒效应调控。而且,神经元中NLG-1-DLG-1、NLG-1-MAGI-1的直接结合作用参与了 GO毒效应调控。此外,AIB、AIY中间神经元参与了秀丽线虫GO回避行为。本研究将加深我们对于GO毒效应神经调控分子机制的理解。