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目的：血管性痴呆(VD)是由一系列脑血管因素（缺血或出血性以及急慢性缺氧性脑血管病）导致脑组织损害所出现脑功能障碍的一种获得性智力损害综合症。对于VD的治疗，目前尚无特效疗法。现代医学主要方法为通过预防脑血管病，对于临床有脑血管病危险因素的患者，包括高脂血症、高血压病、心脏病、糖尿病等，早期进行防治，以预防脑血管病，进而预防VD的发生。导师以往的研究显示姜黄素或姜黄提取物能够通过降低血清及脑组织中MDA含量，升高SOD活性，及使血清及脑组织的ET含量降低，CGRP含量升高，以改善拟血管性痴呆模型小鼠学习记忆能力。为了进一步探讨姜黄提取物治疗VD的机理，本次实验设计为细胞培养，通过姜黄提取物结晶体（包括姜黄素、去甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素）对SK-N-SH细胞谷氨酸损伤保护及Bcl-2、Bax基因和蛋白表达的影响，探讨其治疗VD的机理。方法：1SK-N-SH细胞培养方法SK-N-SH细胞冻存于液氮中，用时进行复苏。培养液为1640培养液，在37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，待细胞长满培养瓶底后，倒掉培养液，消化2-3min，吸弃消化液，加入1640培养液终止消化，用吸管轻轻吹打，使细胞分散开，倒置显微镜下观察，然后用1640培养液将细胞稀释为5×105个/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板，1ml/孔，在其培养条件下继续培养，待细胞长满单层，即可用于实验。2姜黄提取物用少许二甲亚砜(DMSO)溶解配成1×105μmol/L的母液，-20℃冻存备用，临用时用完全培养基稀释至所用浓度，DMSO的含量小于0.1%。3分组：实验时共分为五组，分别为：对照组、模型组、20μmol/L姜黄提取物组、40μmol/L姜黄提取物组、80μmol/L姜黄提取物组。4姜黄提取物对SK-N-SH细胞谷氨酸(Glu)损伤保护的影响姜黄提取物对SK-N-SH细胞Glu损伤模型的保护作用：取细胞铺满单层的24孔培养板，吸弃原培养液，用D-Hank′s液洗1次，每孔加入1640培养液1ml，再加入姜黄提取物进行预保护，使其终浓度分别为20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L，培养1h后加入Glu，使其终浓度为500umol/L，继续培养8h、16h、24h。对照组不加Glu损伤。5观察指标5.1形态学观察倒置相差显微镜下观察各组SK-N-SH细胞生长及形态的变化。5.2MTT法细胞存活力测定在上述损伤发生后的不同时间结束时(8h、16h、24h)，加入MTT (终浓度0.5mg/ml)，继续培养3小时，吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200ul，待孔内颗粒完全溶解后，移入96孔培养板内，用酶标仪(λ=492nm)测定其光密度值(OD)。5.3乳酸脱氢酶(LDH)活性测定按上述损伤发生继续培养16h后，收集培养上清液，按试剂盒说明书测定LDH的活性。6姜黄提取物对Glu诱导SK-N-SH细胞外SOD、MDA含量的影响按上述损伤发生取培养16h后，收集培养上清液，按试剂盒说明书测定SOD、MDA含量。7姜黄提取物对Glu损伤SK-N-SH细胞培养后细胞凋亡的影响7.1采用Western blot检测法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。7.2采用RT-PCR法检测Bcl-2mRNA、Bax mRNA的表达水平。结果：1形态学观察：SK-N-SH细胞在500umol/L Glu作用下有明显的损伤，镜下可见：细胞的突起消失，肿胀圆缩，折光性下降，贴壁能力下降，细胞聚集，部分细胞裂解成碎片；给予姜黄提取物均能明显减轻Glu对SK-N-SH细胞形态的影响，表现为细胞折光性较好，细胞碎片形成减少，细胞聚集减少。2MTT法细胞活力测定及对Glu神经毒性引起的SK-N-SH细胞损伤的抑制率：经Glu处理后的SK-N-SH细胞，模型组对MTT的还原能力下降，8h、16h、24h的OD值均分别明显低于与其相应的对照组(P<0.01)，姜黄提取物三个剂量(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)对SK-N-SH细胞Glu神经毒性损伤模型的OD值明显增高，与模型组比较有明显差异(P<0.01)，8h时三个剂量组的抑制率分别为6.2%、30.7%、60.9%；16h时三个剂量组的抑制率分别为20.3%、42.4%、78.4%；24h时三个剂量组的抑制率分别为19.8%、41.8%、67.3%，均抑制了Glu的损伤，而且在作用16h时各姜黄提取物组的抑制率均较8h、24h高，说明药物在作用16h时效果最好。3培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量及抑制率：经Glu损伤16h后SK-N-SH细胞的LDH释放量，同对照组相比，模型组释放量明显增加(P<0.01)，姜黄提取物三个剂量组(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)对SK-N-SH细胞Glu神经毒性损伤模型LDH的漏出量明显减少，与模型组比较有明显差异(P<0.01)，抑制了LDH的释放，三个药物组的抑制率分别为43.5%、57.8%、76.0%，表明姜黄提取物能明显改善细胞活力。4姜黄提取物对Glu诱导16h时SK-N-SH细胞外SOD、MDA的含量变化：同对照组相比，模型组SOD活力明显下降，MDA含量明显升高(P<0.01)，表明Glu神经毒性引起的SK-N-SH细胞损伤后可出现自由基代谢紊乱。姜黄提取物各剂量组中SOD活性明显升高，同时MDA水平降低，与模型组比较有明显差异(P<0.01或P<0.05)，抑制了Glu的损伤。5Glu神经毒性引起的SK-N-SH细胞损伤16h时Bcl-2、Bax表达的影响：通过Western blot检测法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达情况：同对照组比较，模型组Bcl-2蛋白表达减少，而Bax蛋白表达水平增多，说明造模成功；与模型组比较，各药物组Bcl-2蛋白表达水平增加， Bax蛋白表达水平减少。通过RT-PCR法检测SK-N-SH细胞Bcl-2及Bax的mRNA含量：同对照组比较，模型组Bcl-2的mRNA含量明显减少(P<0.01)，而Bax的mRNA含量明显增多(P<0.01)。与模型组比较，姜黄提取物各组作用的细胞中Bax和Bcl-2转录产物有明显改变，Bcl-2的mRNA含量明显增加(P<0.01或P<0.05)，Bax的mRNA含量明显减少(P<0.01或P<0.01)，说明姜黄提取物在转录水平对Bcl-2表达具有上调作用和对Bax表达下调作用，可以抑制细胞凋亡。结论：1谷氨酸可引起SK-N-SH细胞的损伤；2姜黄提取物对SK-N-SH细胞的谷氨酸损伤具有保护作用；3姜黄提取物治疗血管性痴呆，它可能是通过提高细胞活性，清除自由基，抑制细胞凋亡实现的。