从2002年肿瘤靶向性沙门氏菌VNP20009(VNP)Ⅰ期临床实验开始，肿瘤靶向细菌的研究成为肿瘤生物治疗领域的一个研究热点。肿瘤靶向细菌最为一种全新的肿瘤治疗方法，目前还有许多有待深入研究和阐明之处，例如，与肿瘤靶向功能及抗肿瘤活性相关的基因的鉴定及其功能研究几近空白，细菌抗肿瘤机理尚有待进一步阐明，细菌抗肿瘤活性与机体免疫调节的关系尚不清楚，细菌在临床抗肿瘤的疗效尚不理想，细菌作为肿瘤靶向载体进行肿瘤基因治疗的基础及应用亟待加强，等等。本论文针对肿瘤靶向性细菌研究领域存在的上述关键科学问题，以减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP为研究对象，开展下述系列研究:1。肿瘤靶向性细菌介导的肿瘤组织靶向性递送和肿瘤组织选择性表达的基因治疗及其机制研究:以肿瘤靶向减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP携带肿瘤组织乏氧特异性启动子开展肿瘤的基因治疗研究;2。传统抗肿瘤中药单体化合物雷公藤内酯醇提高细菌肿瘤靶向性及其抗肿瘤疗效效果及其作用机制研究;3。细菌鞭毛相关基因对其抗肿瘤效果的影响及其机理研究。　　第一章中，我们发现肿瘤靶向沙门氏菌虽然具有较高的肿瘤靶向性(肿瘤:肝脾＞1∶1000-10000)，但是仍可以少量的在肝脏和脾脏以及其它脏器内进行短时间的繁殖，因此，利用它作为肿瘤靶向基因载体进行肿瘤治疗时，可能会造成其它脏器非特异性的表达，从而造成额外的毒性。本文中，我们首先利用大肠杆菌厌氧诱导启动子PnirB，针对肿瘤内厌氧坏死的微环境，将治疗基因的表达限制在肿瘤核心的乏氧区域内。通过构建厌氧启动子PnirB表达临床公认的抗肿瘤药物TRAIL和Endostatin，在体外，我们通过Luciferase报告基因和GFP方法，证实了启动子的厌氧诱导特性并同时验证了治疗基因在厌氧下特异性的表达。在体内，我们也通过Luciferase报告基因方法验证了PnirB在肿瘤内的特异性表达和体内的稳定性，同时也验证了肿瘤内药物蛋白特异性的表达。进而，我们通过小鼠的黑色素瘤皮下肿瘤模型进一步验证了VNP携带厌氧启动子PnirB和治疗基因TRAIL和Endostatin进行抗肿瘤研究，我们发现靶向基因治疗具有显著的抑制肿瘤生长的特性。与此同时，我们还围绕了治疗基因TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡和化疗药物增强细胞凋亡开展了研究，对Endostatin抑制肿瘤内CD31阳性血管内皮细胞和VEGF（血管内皮细胞生长因子）的产生进行研究。我们得出结论:利用沙门氏菌VNP携带PnirB厌氧启动子可以有效地驱动肿瘤内治疗基因的表达，从而达到靶向基因治疗的效果。　　第二章中，首先，我们发现外源基因的存在会影响沙门氏菌VNP自身的代谢和外源基因在VNP内的表达。我们通过利用二维电泳(2D)和质谱方法(MS)来筛选沙门氏菌VNP内源性的厌氧启动子，构建了具有自主知识产权的肿瘤组织选择性表达的细菌基因治疗系统。通过利用2D和MS方法比较细菌在有氧和厌氧生长环境下蛋白质表达谱的差异，我们发现一些厌氧环境下高表达的细菌内源性蛋白，从中挑选出评分最高的蛋白——乙醇脱氢酶(AdhE)。我们对adhE基因的启动子进行分段克隆并验证其厌氧表达特性。最终筛选出1200bp长度的乙醇脱氢酶高度厌氧启动子PadhE。首先，我们在体外用GFP方法验证其厌氧表达特性，发现只有在厌氧条件下PadhE才会表达，同时，我们也利用Luciferase报告基因的方法来证明其在肿瘤内特异性表达，而在肝脏脾脏内没有表达。进而，我们利用鸡胚尿囊膜实验验证PadhE携带Endostatin（内皮抑素）对血管生成的抑制效果，我们发现在厌氧下诱导PadhE表达Endostatin的裂解上清可以有效而显著地抑制尿囊膜上血管的生成。为了更好的说明VNP-PadhE系统的可行性，我们还通过鼠的B16F10黑色素瘤和Lewis肺癌皮下模型，对VNP携带PadhE靶向表达Endostatin的抗肿瘤效果，我们发现靶向基因治疗组有很显著地抑瘤效果，进而我们也通过免疫组化和ELISA方法验证了肿瘤血管抑制的效果。　　第三章中，我们主要围绕通过药物联合使用提高细菌的肿瘤靶向性进行了相关研究。VNP的Ⅰ期临床试验表明，在病人体内VNP未能表现出显著的抑制肿瘤生长的效果，并发现VNP在肿瘤内的定殖数量很少。因此，提高沙门氏菌VNP肿瘤定殖能力是影响其作为进一步临床实验的关键。我们发现中药单体药物-雷公藤内酯醇(Triptolide)可以在一定剂量内促进VNP在肿瘤内的定殖能力，而不会提高其它组织的细菌量，即可以显著提高VNP的肿瘤靶向性。进一步研究发现，Triptolide可以抑制肿瘤内粒细胞的浸润，通过粒细胞的瘤内功能性缺失实验可以放大细菌在肿瘤内的滴度和扩散能力。我们证实Triptolide是通过抑制肿瘤内粒细胞浸润来提高细菌的肿瘤定殖能力的;除此之外，我们还发现Triptolide可以抑制肿瘤内的血管生成，这主要是表现为抑制肿瘤内CD31内皮细胞和抑制肿瘤内VEGF的表达。进一步研究发现:通过中和VEGF瘤内功能，细菌也可以在肿瘤内大量扩散并产生更多的坏死区。因此，Triptolide还可以通过抑制肿瘤内血管来提高肿瘤内厌氧坏死区从而方法细菌在肿瘤内的滴度。VNP在肿瘤内的大量定殖会引发大量CD8阳性T细胞的肿瘤内浸润，并显著提高荷瘤鼠血清中的TNFα和IFN-γ含量诱发免疫应答效应和抗肿瘤效应;雷公藤可以抑制VNP对肿瘤细胞内NFκB信号的激活，从而促进肿瘤细胞凋亡。　　我们认为，肿瘤内血管的抑制和粒细胞浸润的抑制可以提高VNP的肿瘤靶向性，进而为进一步的临床学试验的成功提供了一定的理论基础。　　在上述研究的基础上，我们进一步探讨了VNP鞭毛相关基因flhD(主调节基因)和fliE（Hook-basal body，鞭毛基体结构基因）对VNP抗肿瘤活性的影响及其作用机制。我们构建了VNP flhD基因和fliE基因的基因敲除突变菌，发现VNP的鞭毛相关基因对其抗肿瘤效果具有重要的作用。基因flhD和fliE的缺失会造成VNP抗肿瘤特性的降低甚至消失，鞭毛缺陷菌株△flhD和△fliE在体外对B16F10肿瘤细胞的侵染性显著下降;在体内，鞭毛缺失的细菌也显著减少，肿瘤内细菌滴度也显著降低。尽管鞭毛缺失菌株的抗肿瘤效果显著不如VNP，但是△fliE仍然表现出显著的抗肿瘤效果，而△flhD没有任何治疗效果。　　进一步研究发现VNP的抗肿瘤效果依赖于免疫系统，免疫介导了细菌的抗肿瘤效应。我们发现，鞭毛参与了细菌诱发的免疫反应，而且细菌的侵染能力较大程度上决定了能否会诱发抗肿瘤免疫效果。在VNP抗肿瘤过程中，我们发现肿瘤内有大量的白细胞浸润，其中主要有T细胞、粒细胞和巨噬细胞。鞭毛缺失菌株处理后，肿瘤中这些细胞则显著减少。VNP处理后，肿瘤内炎症信号通路MAPK被激活、其下游的炎症因子和趋化因子表达升高。细菌的感染能力能够影响肿瘤内炎症信号的激活。鞭毛蛋白(Flagellin)是TLR5信号的唯一的特异性配体，我们在体外和体内分别证实了肿瘤细胞可以稳定表达TLR5。VNP给药后TLR5过表达的肿瘤受到了显著的抑制，TLR5显性负性突变体在肿瘤内过表达却显著消弱了VNP的抗肿瘤效果，从而证实VNP的抗肿瘤效果依赖于TLR5信号。我们的工作证实了细菌侵染对免疫系统的调节作用，这种调节功能对其抗肿瘤效果至关重要;细菌对肿瘤内的TLR信号通路的调节作用也参与了其抗肿瘤效应;细菌本身的代谢对其抗肿瘤效果也有较大影响。