论文部分内容阅读
对乙型肝炎病毒（HBV）野生株及核壳蛋白变异株L97和V60在HepG2细胞HLA-I表面表达的特性及其调节机制进行初步探讨，试图认识病毒及其变异与宿主细胞相互作用和影响。 构建HBV基因组野生株和核壳蛋白变异株稳定表达载体，提供实验研究的基础材料。通过定点突变技术将1.2拷贝HBV（adr亚型）野生株质粒p3.8Ⅱ构建成核壳蛋白变异株L97和V60质粒，经序列测定证实nt2189A→C和nt2078C→G。3株质粒转染HepG2细胞DNA的Southern blot杂交均显示明显的3.8kb杂交带，培养上清均测定出HBV抗原，表明具有生物活性，分别亚克隆入EB病毒表达载体EBO-plpp使能稳定表达。重组载体EBO-WT、EBO-L97和EBO-V60作限制性内切酶酶切鉴定及再次测序确定点突变。 测定HBV野生株和变异株L97、V60诱导HepG2细胞膜HLA-I／抗原肽复合物表达的强度，探讨各株在宿主细胞HLA-I表面表达的特性及核壳蛋白热点变异对HLA-I表达的影响。3株HBV重组载体及EBO空载体分别转染HepG2细胞，定期定量更换培养液，重复转染实验3次。稳定传代后测定上清中HBV抗原平均含量结果，3株HBV表达的HBeAg s／co值不同，但HBsAg S／N值相近，表明各株重组载体的转染率相当。收集细胞，用FITC标记抗HLA-ABC单抗染色，流式细胞仪测定结果，未转染的和EBO空载体转染的HepG2细胞表面HLA-I轻微表达，荧光强度为1.8和2.2，3株HBV重组载体转染细胞的HLA-I荧光强度增高水平各异，WT增强为182，L97升高至34.5，而V60仅为3.4。提示HBV能增强HePG:细胞膜上HLA一I的表达，核壳蛋白热点变异L97和V60可影响宿主细胞HLA一I表面表达的强弱。 测定3株HBV转染HePG:细胞内的HLA一I重链基因及抗原提呈相关基因（LMPZ、TAP，、几pasin）的表达，并分析宿主细胞内细胞因子的诱导作用，初步探讨HBV上调H叩G:细胞HLA一I表面表达的机制。以EBO空载体转染细胞为对照，RT一PCR半定量法及场七Stem blot测定HBV转染细胞内的HLA一A基因mRNA表达和HLA一I基因蛋白质表达均出现明显条带，EBO一L97、EBO一WT和EBO一V60的HLA一A eDNA带及HLA一I蛋白质带强度依次减弱，与HLA一I表面表达荧光强度的差异趋势一致。RT一PCR半定量法分析转染细胞内3个抗原提呈相关基因的转录水平结果，3株HBV宿主细胞TAP，基因mRNA表达明显较对照细胞增强，株间无明显差异，各样本均未测出LMP:基因及几pasin基因mRNA表达。提示HBV诱导转染细胞内HLA一A基因重链合成量及1人P:基因转录水平增高，可上调细胞的HLA一I表面表达。RT一PCR法检测出EBO一WT和EBO一L97转染细胞内的TNF一Q基因mRNA表达，其cDNA条带强度相近，未测出IFN一p基因mRNA表达。经抗TNF一Q单抗阻断的EBO一WT和EBO一L97转染细胞与未经处理的对应株宿主细胞对比，其胞膜上HLA一I荧光强度从7.78降至3.89和12.28降至6.21，但仍高于空载体转染细胞HLA一I荧光强度1 .31，其细胞内HLA一A基因及TAPI基因mRNA表达减弱，提示HBV能诱导HePG:细胞内TNF一基因mRNA表达，未诱导IFN一p mRNA表达，HBv转染细胞的HLA一I表面表达增强部分依赖于内源性TNF一Q的诱导作用，TNF一Q在HLA一A基因及1’AP，基因的转录水平有部分正调节作用。核壳蛋白变异L97和V6O使宿主细胞内HLA一I基因mRNA表达及蛋白质表达水平发生差异，而可影响胞膜HLA一I表达。