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研究目的以靶向EGFR的纳米抗体7D12为载体,南瓜蛋白作为“弹头”,采用基因工程的方法,设计、构建、表达及纯化重组免疫毒素rE/CUS,检测其体外抗肿瘤活性。研究方法1.构建重组免疫毒素rE/CUS的表达载体:根据本课题组已知的CUS基因及纳米抗体7D12基因序列,设计引物,并引进合适的酶切位点和保护性碱基。以p ET-32a-CUS和p ET-32a-7D12为模版,进行聚合酶链反应(PCR),扩增产物纯化后,挑选阳性克隆进行测序;将测序正确的CUS基因及纳米抗体基因通过(G4S)3连接,通过重叠延伸PCR进行扩增,扩增产物纯化后,进行酶切验证,挑选阳性克隆测序。经过重组克隆筛选,将测序正确的阳性克隆菌转化E.coli;通过原核表达系统表达重组免疫毒素rE/CUS,IPTG低温诱导表达,并通过Ni离子亲和层析纯化目的蛋白。2.采用SDS-PAGE与Western blot法鉴定重组蛋白rE/CUS表达结果。3.流式细胞术检测肿瘤细胞株肝癌细胞(HepG2)、非小细胞肺癌细胞(A549)、大肠癌细胞(SW116)和结肠癌细胞株SW620的EGFR的表达情况及重组免疫毒素rE/CUS与各肿瘤细胞株的结合活性。4.采用磺酰罗丹明B比色法,检测重组免疫毒rE/CUS对肿瘤细胞株肝癌细胞(Hep G2)、非小细胞肺癌细胞(A549)、大肠癌细胞(SW116)和结肠癌细胞株SW620的体外杀伤作用研究。5.采用流式细胞术检测不同浓度的rE/CUS诱导肝癌细胞(HepG2)、非小细胞肺癌细胞(A549)的凋亡情况。6.Western blot法检测rE/CUS对HepG2细胞PI3K、Akt、mTOR、P70S6K、Bax、Bcl-2、Caspase 9、cleaved-caspase 3蛋白表达水平的影响。研究结果1.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可见1100bp特异性条带,与预期大小一致,测序结果表明,rE/CUS全长基因1161bp,编码386个氨基酸,表明重组质粒构建成功。2.重组免疫毒素经IPTG诱导表达,获得带有多聚组氨酸(His)6的融合蛋白,超声裂解显示蛋白大部分以包涵体的形式存在于沉淀中,部分蛋白可溶性表达于溶液中,经Ni离子亲和层析柱纯化,每升菌液中获得5mg的可溶性蛋白。3.SDS-PAGE结果可见42k Da处有一特异性条带,与预期的重组免疫毒素的分子量大小一致,Western blot显示重组蛋白rE/CUS可与南瓜蛋白抗体及鼠-抗His抗体特异性结合。4.rE/CUS与EGFR高表达的肿瘤细胞株肝癌细胞(Hep G2)、非小细胞肺癌细胞(A549)、大肠癌细胞(SW116)具有结合活性,而与EGFR低表达的结肠癌细胞株SW620无结合活性。5.rE/CUS对肿瘤细胞株的杀伤作用研究结果表明,单用7D12对EGFR高表达的肿瘤细胞株(Hep G2、A549和SW116)和EGFR阴性细胞株SW620均无明显的增殖抑制作用,r CUS对上述四种细胞有一定的增殖抑制作用,作用72h的IC50分别为(466.3±0.483)nmol/L、(716±0.760)nmol/L、(208.33±0.056)nmol/L和(263±0.044)nmol/L;重组免疫毒素rE/CUS对Hep G2细胞、A549细胞和SW116细胞的增殖抑制作用明显,且呈剂量依赖性和时间依赖性,作用72h的IC50分别为(2.15±0.226)nmol/L、(18.33±0.018)nmol/L和(2.33±0.032)nmol/L,而对SW620细胞增殖抑制作用弱,作用72h的IC50为(463±0.086)nmol/L。6.流式细胞术显示,rE/CUS可诱导肝癌细胞HepG2和非小细胞肺癌细胞A549凋亡,32nmol/L rE/CUS诱导Hep G2的凋亡率为47.4%,10nmol/L rE/CUS诱导A549细胞的凋亡率为56.3%。7.Western blot法检测结果显示,不同浓度的rE/CUS作用于Hep G2细胞,细胞PI3K、AKT、m TOR、P70S6K、Bcl-2蛋白表达逐渐减弱,Bax、Caspase 9、cleaved-caspase 3蛋白表达逐渐增强,呈明显的浓度依赖性。结论1.本研究成功构建了重组免疫毒素rE/CUS的表达载体,诱导表达并纯化重组蛋白rE/CUS。2.rE/CUS对EGFR高表达的肿瘤细胞株肝癌细胞(Hep G2)、非小细胞肺癌细胞(A549)、大肠癌细胞(SW116)具有显著的杀伤作用。3.rE/CUS诱导Hep G2细胞凋亡的机制可能与下调PI3K、Akt、m TOR、P70S6K、Bcl-2蛋白水平的表达,进而激活caspase9,并最终激活下游caspase3有关。