2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）是以高血糖为特征的一种糖脂代谢紊乱性疾病,是糖尿病的主要类型。患者肝组织常有以甘油三酯为主的脂质沉积,加重糖尿病肝脏的损伤[1]。但脂质沉积的详细机制尚不清楚。游离脂肪酸进入肝细胞后,在内质网内经一系列反应化合成甘油三酯,以脂滴的形式储存起来,需要能量时,脂滴被分解成脂肪酸,进而氧化供能。真核细胞中脂肪酸的氧化有两条途径,一条是线粒体β-氧化途径,主要分解短链、中长链以及长链脂肪酸;另一条则是过氧化物酶体β-氧化途径,主要分解极长链脂肪酸（>C22）和支链脂肪酸生成短链的脂肪酸,后者被转到线粒体,经线粒体β-氧化途径继续分解为乙酰辅酶A后氧化供能[2]。虽然线粒体β-氧化途径在脂质分解减少脂质在肝脏中聚集中起着核心作用,但新近的研究发现,过氧化物酶体β-氧化途径也可以分解中、长链脂肪酸[3],从而抵消代谢应激期间肝细胞中脂质的积累[4]。在非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）不同进展阶段中,过氧化物酶体也会和线粒体共同发挥脂肪酸的分解作用[5]。2型糖尿病时,由于胰岛素抵抗,细胞利用葡萄糖分解供能下降,肝脏细胞转而利用脂肪酸氧化供能,同时合成脂肪以脂滴的形式储能。当脂滴中的脂质分解减弱,2型糖尿病合并脂肪肝脏。此时,肝脏中的过氧化物酶体功能是否发生了变化?肝脏的脂质沉积是否与之有关呢?为此,本实验以2型糖尿病合并脂肪肝大鼠模型和油酸处理的HepG2细胞为实验对象,以过氧化物酶体膜蛋白:过氧化物酶体膜蛋白70（peroxisomal membrane protein 70 k Da,PMP70）和过氧化物12（Peroxin 12,PEX12）,以及过氧化物酶体基质蛋白过氧化氢酶（catalase,CAT）的表达水平作为细胞过氧化物酶体功能变化的指标,在动物水平和细胞水平上探讨过氧化物酶体在2型糖尿病肝脏中脂质沉积过程中的作用,为2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的防治提供理论依据和新的治疗思路。目的:1.确定2型糖尿病非酒精性脂肪肝中过氧化物酶体的功能有无变化。2.确定过氧化物酶体功能失调对细胞中脂质沉积的影响。方法:1.参考文献（M.J.Reed）中的方法,利用高糖高脂饮食加小剂量STZ注射的方法建立2型糖尿病合并脂肪肝模型。血清生化检测大鼠血糖血脂的各项指标,HE染色和油红O染色法观察大鼠肝脏中炎症浸润和脂质沉积情况。Western Blot和q RT-PCR法检测过氧化物酶体基因的改变。分光光度法检测组织甘油三酯的含量,并用相关性分析法分析肝脏中甘油三酯含量与过氧化物酶体基因PMP70和PEX12 m RNA水平的相关性。2.正常培养的HepG2细胞给予同一时间不同浓度和同一浓度不同时间的油酸刺激后,油红O染色观察细胞中的脂质沉积情况,确定不同条件下油酸对细胞中脂质沉积的影响。3.正常培养的HepG2细胞给予油酸6个小时后分别转染si-PEX12或si-PMP70 24小时,油红O染色和分光光度法检测细胞中脂质沉积的情况并测定细胞中甘油三酯和总胆固醇含量,确定敲低PEX12或PMP70对油酸导致的细胞中的脂质沉积的影响。结果:1.模型大鼠肝组织结构异常且脂质沉积。大鼠血清生化指标检测结果显示,相比对照组,模型组大鼠血糖浓度显著升高（5.76±1.52 vs 31.2±7.93 mmol/L,P<0.001）,甘油三酯TG（0.53±0.11 vs 2.23±0.89 mmol/L,P<0.001）、总胆固醇TCh（2.09±0.23 vs 12.73±3.94 mmol/L,P<0.001）和低密度脂蛋白胆固醇LDL-C（0.82±0.07 vs 7.05±1.18 mmol/L,P<0.001）含量显著升高,高密度脂蛋白胆固醇HDL-C（1.52±0.11 vs 0.54±0.22 mmol/L,P<0.001）含量显著降低。大鼠肝脏组织经HE染色和油红O染色镜检,相比对照组,可见模型组大鼠肝脏有明显的炎症浸润和脂质沉积。分光光度法测定结果显示,模型组大鼠肝脏组织内的甘油三酯含量显著高于对照组（302.13±100.22 vs 123.93±38.52 nmol/mg prot.,P<0.01）。表明,2型糖尿病合并脂肪肝大鼠模型成立。2.模型大鼠肝脏中脂质的沉积伴随过氧化物酶体相关基因表达降低。Western blot和q RT-PCR结果显示,与对照组相比,模型组大鼠肝脏中过氧化物酶体相关基因PMP70、CAT、PEX12 m RNA和蛋白表达量显著下调（P<0.001,P<0.01）。免疫荧光染色结果显示,模型组中肝组织标记的PMP70红色荧光也显著低于对照组。大鼠肝脏组织中PMP70和PEX12的m RNA水平分别与甘油三酯含量呈明显负相关（R=-0.8426,P<0.01;R=-0.7819,P<0.01）。表明,2型糖尿病大鼠脂肪肝中,过氧化物酶体相关基因表达降低,即过氧化物酶体功能的改变可能与肝脏中甘油三酯的沉积有关。3.油酸以浓度和时间依赖的方式增加HepG2细胞中脂质的含量。用不同浓度油酸（31.25、62.5、125、250、500μmol/L）刺激HepG2 24h,或用125μmol/L油酸刺激HepG2不同时间（0 h、3 h、6 h、9h、12 h、24 h）后进行油红O染色,结果显示,细胞中脂质呈油酸浓度依赖和时间依赖性增加。表明,油酸能够使脂质在HepG2细胞中沉积。4.敲低PEX12加重了HepG2细胞油酸导致的脂质增加。HepG2细胞给予62.5μmol/L油酸刺激6 h后转染si-PEX12 24 h。油红O染色和分光光度法的结果显示,敲低PEX12后,增加了油酸处理细胞中的脂质沉积和甘油三酯含量（P<0.05）,对细胞内的胆固醇的量没有影响（P>0.05）。但正常培养细胞敲低PEX12后,对细胞中脂质、甘油三酯以及胆固醇的量均无影响（P>0.05）。表明,高脂条件下,PEX12的表达降低可加重细胞油酸诱导的,以甘油三酯为主的脂质沉积。5.敲低PMP70加重了HepG2细胞油酸诱导的脂质的增加。HepG2细胞给予62.5μmol/L油酸刺激6 h后转染si-PMP70 24 h。油红O染色和分光光度法的结果显示,敲低PMP70后,增加了油酸处理细胞中的脂质沉积和甘油三酯含量（P<0.05）,对细胞内的胆固醇的量没有影响（P>0.05）。但正常培养细胞敲低PMP70后,对细胞中脂质、甘油三酯以及胆固醇的量均无影响（P>0.05）。表明,高脂条件下,PMP70的表达降低可加重油酸诱导的,以甘油三酯为主的脂质沉积。以上结果提示:1.2型糖尿病大鼠脂肪肝中过氧化物酶体的功能降低。2.过氧化物酶体功能下调加重肝细胞高脂诱导的甘油三酯沉积。结论:过氧化物酶体的功能降低可能是2型糖尿病脂肪肝的原因之一。