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单核细胞增生李斯特菌是重要的食源性致病菌,它具有形成菌膜的特性。通过对功能和调控基因的研究来探讨单核细胞增生李斯特菌菌膜的形成机制,可望建立防治该细菌污染食品的方法。
本文使用电转化的方法,将携带转座子Tn917的质粒pTV1-OK转化到单核细胞增生李斯特菌中,并诱导转座,获得了1880多个突变株,加上本实验室前期构建的突变株,使实验室单核细胞增生李斯特菌Tn917转座突变株库增加到2200株。
本文使用96孔细胞培养板对随机挑选的1000余株突变株进行菌膜培养。培养后的96孔细胞培养板清洗后用结晶紫染色,测OD595值来表示菌膜形成量的筛选依据,从而挑选到菌膜形成能力变小的突变株8株,目标突变获得率约为8‰。对筛选出的菌膜形成量变小的突变株进行荧光显微镜观察,证实该8株突变株菌膜形成能力弱于野生菌株。最后通过PCR验证,证明这8株突变株的基因组中有Tn917的插入,这可能是它们表型发生变化的原因。
以所突变株LM-301基因组DNA为模板,采用IPCR(inverse PCR)方法扩增插入位点旁侧基因,将IPCR产物片段测序及BLASTn比对,结果显示该基因可能编码细胞表面锚定蛋白。