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癌症是当今危害人类的第一杀手。放射治疗和化学药物治疗仍然是治疗肿瘤和防止肿瘤复发的主要手段,放化疗的主要副作用是骨髓的造血和免疫功能抑制。因此深入研究治疗化疗后骨髓抑制的药物在癌症治疗中具有重要的意义。对于严重骨髓抑制的治疗,目前较多地采用干细胞移植的方法。但是,造血干细胞移植后病人骨髓造血和免疫功能恢复需要较长的时间,必须配合应用大量的药物控制感染和防止出血,导致医疗费用昂贵,病人难以承受。应用全基因组表达芯片,我们对小鼠骨髓再生过程中骨髓全基因组表达谱作了系统研究,发现基质细胞衍生因子-1(SDF-1,又名CXCL12)的基因表达与骨髓损伤和修复相关。近年来趋化因子及其受体在造血调控中的作用日益引起人们的关注,基因敲除SDF-1和其受体CXCR4导致骨髓B淋巴细胞生成和粒细胞生成障碍,表明SDF-1与骨髓造血调控有关。但是,还未见有关SDF-1治疗化疗骨髓副作用的研究报道。本课题拟制备人SDF-1α重组蛋白,研究其对小鼠骨髓造血的调控作用和治疗骨髓抑制的药效学作用。本研究从该基因克隆开始,构建了原核表达重组质粒,在大肠杆菌中进行蛋白的诱导表达,经过蛋白变性与复性后,经阴离子交换层析过柱纯化,并测定重组蛋白的生物学活性和内毒素含量。将重组蛋白注射正常小鼠及经5-氟脲嘧啶(5-Fu)处理后骨髓抑制的小鼠,研究其对骨髓造血的作用。本研究的主要结果和结论如下:通过PCR方法从人骨髓cDNA文库中克隆得到人基质细胞衍生因子-1α(hSDF-1α)成熟肽目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳验证约213bp大小,将回收产物克隆到pET28a(+)空载体中构建重组质粒pET28a(+)-hSDF-1α;转化到非表达宿主菌DH5α后,菌落PCR方法筛选鉴定,测序证明与hSDF-1α成熟肽基因序列一致。将重组质粒pET28a(+)-hSDF-1α转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经过蛋白表达的优化,确定最佳的诱导条件为37℃诱导过夜,Kana浓度为100ug/mL的LB培养基,IPTG浓度为1mmol/L。用IPTG诱导1L菌液,蛋白主要以包涵体形式存在,分子量大小8kDa。离心获得菌体,经超声和溶菌酶双重破菌后,洗涤包涵体,用pH11.0的8M尿素进行包涵体变性,在pH11.0的复性液中进行稀释复性,经阴离子交换层析后获得目的蛋白溶液。BSA蛋白定量法测得其浓度为0.67mg/mL,SDS-PAGE鉴定结果表明重组蛋白纯度大于95%。测定重组蛋白的内毒素含量和生物学活性,用显色基质鲎试剂盒测定蛋白的内毒素含量小于1EU/ug,且具有体外促小鼠脾脏T细胞趋化活性。用重组蛋白注射正常小鼠和5-Fu骨髓抑制小鼠进行药效学研究,SDF-1重组蛋白显著升高正常小鼠骨髓细胞总数,揭示hSDF-1α具有促进骨髓再生功能;hSDF-1用药后注射5-Fu,小鼠对骨髓抑制药物5-Fu的敏感性显著增加,提示hSDF-1具有促进更多骨髓细胞进入细胞周期的功能;而5-Fu注射后给予hSDF-1蛋白也显著延迟外周血细胞的恢复,提示外源性hSDF-1在骨髓损伤后的修复中具有抑制作用。本课题为进一步研究SDF-1在骨髓损伤中的作用和作用机理奠定了实验基础。