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失眠症是以入睡和(或)睡眠维持困难所致的睡眠质量或数量达不到正常生理需求而影响社会功能的一种主观体验,是最常见的睡眠障碍性疾患,并且患病率很高。据世界卫生组织调查,在世界范围内约1/3的人有睡眠障碍,而在中国患有各类睡眠障碍的人的比例明显高于世界27%的水平。因此,失眠的有效防治仍为全球关注的热点。在临床治疗上,现代医学主要采用镇、催眠药物,而药物治疗给患者带来许多副作用,远期疗效较差,长期的服用还会造成成瘾性、耐受性等,并非一种理想的治疗方法。蒙古医学治疗失眠具有独特的理论和良好的疗效,蒙医认为"三根失衡,赫依偏盛而位于心和白脉,其功能紊乱致赫依血相搏"是本病的基本病因病机,紧张、忧虑、恐惧、抑郁、焦虑等负面情绪及社会环境、饮食、起居、运动情况等均是外因,镇赫依、调节"三根"平衡为主要治疗原则。蒙医温针疗法是用特制的银针在人体的固定部位或其它部位给予针刺加温灸刺激,以达到预防和治疗疾病目的的一种蒙医传统疗法。蒙医温针是集针刺效应、温热效应以及穴位特异性刺激为一体,通过对血液循环、神经系统、免疫功能等多系统、多渠道、多途径的复杂机制,达到调节机体、治疗疾病的目的。蒙医温针疗法是蒙医治疗失眠的常用方法之一,具有温通经脉、调和气血、调理体素、增强抵抗力以及防治疾病的作用。蒙医文献记载与现代临床实验证明,蒙医温针疗法对失眠症的疗效显著,同时具有无毒副作用安全可靠、简便易行等优点。因其高效、安全、无副作用、简单易行、不产生药物依赖等特点而广泛被患者所接受。本课题首次通过蒙医温针刺激失眠大鼠来考察miRNAs的变化水平,从整体上而非单一指标来衡量失眠导致动物整体基因水平的变化情况,是一种全新的科学思维,符合蒙医整体观的理论。寻找相应的靶基因,从基因层面考察温针治疗前后相关细胞因子、神经递质及与其受体特异性结合的变化规律,以及对PCPA失眠大鼠行为的影响,符合传统医学的现代思维,也是一种全新的尝试,并且能够为蒙医基础研究确定出特异性的治疗失眠相关分子靶点提供参考和依据。研究目的本课题以蒙医温针对PCPA致失眠大鼠模型的催眠作用为切入点,考察失眠大鼠行为学相关指标,从基因水平对温针治疗前后相关miRNAs及靶基因进行探讨,同时对失眠相关细胞因子、神经递质含量观察,探讨蒙医温针治疗失眠症的生物学基础,初步阐明蒙医温针疗法的多层面复杂机制。研究方法1.选择腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠大鼠模型,将90只SD健康雄性大鼠,分为空白组Ⅰ、空白组Ⅱ、模型组、温针组、模型+温针组及模型+西药组,每组15只,造模完成后进行行为学检测,即一般情况观察、自主活动度、睡眠潜伏期和睡眠持续时间测定。2.观察miR-101a在蒙医温针治疗失眠大鼠前后脑组织中的表达差异,并结合生物信息学技术,构建miR-101a及PAX8载体,采用荧光定量PCR、荧光素酶报告基因、蛋白印迹检测等不同方法验证miR-101a对PAX8基因的靶向调控关系,从不同层面上观测温针治疗前后PAX8的变化规律。3.采用酶联免疫吸附法、高效液相色谱加电化学(HPLC-ECD)等检测各组大鼠脑组织的细胞因子IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α及单胺类神经递质甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)的水平。结果1.睡眠时间:蒙医温针组与空白组比较睡眠时间延长,有明显差异(P<0.01);蒙医温针对大鼠入睡率无作用,与空白组比较无显著差异(P>0.05);对睡眠潜伏期无明显作用,与空白组比较无显著差异(P>0.05)。2.自主活动度:自由活动上,各组大鼠失眠第七天,模型组在活动时间上明显高于空白组(P<0.01);模型组的停留时间高于空白组,但无明显差异(P>0.05)。站立次数上,模型组站立次数明显高于对照组,有明显差异(P<0.05);蒙医温针组明显低于模型组(P<0.05)。3.相对于正常大鼠,蒙医温针治疗后,有141个miRNAs表达存在差异;变化最为显著的为miR-101a,相比模型组升高了 98倍。我们接下来对15只温针治疗失眠大鼠的miR-101a的水平进行了荧光实时定量PCR研究,发现中位数由模型组的的-2.9倍上升到了 3.2倍(P<0.01)。通过荧光实时定量PCR检测发现,相对于正常大鼠的脑组织细胞,失眠模型组大鼠脑组织miR-101a的表达水平明显下调(p<0.05);经过温针治疗后,miR-101a的表达水平明显上升,恢复到接近正常值(p<0.05)。空白神经细胞中,相对于阴性对照组,转染miR-101 a mimics的细胞中72小时后miR-101a的表达量明显升高(p<0.05),转染miR-101ainhibitor显著降低(p<0.05);在失眠模型组中,相对于阴性对照组,转染miR-101a mimics的细胞中72小时后miR-101a的表达量明显升高(p<0.05),转染miR-101a inhibitor无显著变化;蒙医温针治疗后,相对于阴性对照组,转染miR-101a mimics的细胞中72小时后miR-101a的表达量明显升高(p<0.05),转染miR-101ainhibitor显著降低(p<0.05)。4.蛋白印迹结果显示:体外培养失眠模型大鼠神经元细胞,对比加入scramble组加入miR-101amimics72小时后,PAX8蛋白的表达出现抑制,呈显著的下调(P<0.01);荧光素酶报告结果显示:相对于空白质粒组pGL3M,阴性对照组pGL3M-MUT-PAX8-3’ UTR及pGL3M-WT-PAX8-3’ UTR均没有显著性变化,加入miR-101a mimics后,MUT组的活性没有出现显著性的变化,而WT组荧光强度显著下降,说明miR-101a能够与WT-PAX8-3’ UTR启动子中特异顺序结合,而改变了启动子的特异序列,则miR-101a不起作用。5.失眠大鼠下丘脑、海马和大脑前额叶皮质组织中白细胞介素IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α水平与空白对照组相比明显降低(P<0.05)。经过治疗后,无论是温针治疗还是西药治疗,各部位白细胞介素IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α水平与模型组相比均显著提升(P<0.05)。对大鼠脑组织中神经递质水平检测结果显示,失眠模型组大鼠NE、DA、Glu水平明显高于空白对照组(P<0.05),而经过温针或西药治疗,NE、DA、Glu水平则与失眠模型组相比较有了明显降低,差异显著(P<0.05),温针治疗效果和西药治疗效果差异不明显,说明两者治疗效果相近。失眠模型组大鼠5-HT、GABA、Ach水平明显低于空白对照组差异显著(P<0.05),与失眠模型组比较,温针或西药治疗后失眠大鼠5-HT、GABA、Ach水平明显升高,差异显著(P<0.05)。结论1.蒙医温针疗法可显著改善失眠大鼠的行为状态及睡眠持续时间。2.蒙医温针疗法可直接上调失眠大鼠体内miR-101a水平,并且验证了蒙医温针改善失眠与miR-101a调节PAX8基因有直接关联。3.蒙医温针可对失眠大鼠脑组织中IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α及(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)异常起到调节作用。4.蒙医温针通过上调miR-101a及PAX8基因,对多种神经递质起到了调节作用。5.蒙医温针疗法通过"镇赫依"、"改善气血"、提高免疫力等作用,具有良好的改善失眠的功能。同时具有操作简便、安全有效、毒副作用小等优势及特点。