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纳米纤维素晶体(Cellulose nanocrystals,CNC)是一种由天然纤维素制备而成的直径在3-10 nm且长径比大于5的纳米级的纤维素。与纳米纤维素(Nanofibrillated cellulose,NFC)相比,CNC具有高结晶度、长径比小、比表面积大等诸多优点,表面基团中含有大量带负电荷的羟基,使其具有显著的表面活性,可作为新型膳食纤维、脂肪替代品和食品稳定剂在食品中应用。笋头是竹笋基部无法食用的部分,约占全笋的40%。我国每年有大量的笋头作为农业废弃物被丢弃,造成浪费以及环境污染。笋头中含有丰富的纤维素,是用于CNC制备的廉价新型原料,对于提高竹笋的综合利用和经济价值具有重要的意义。基于此,本实验以福建省绿竹笋笋头为原料,优化笋头CNC的硫酸水解法制备条件,分析了其结构表征和理化性质,最后通过人体结肠癌细胞(Caco-2)毒理学研究验证笋头CNC的安全性。主要研究结果如下:(1)在课题组成功制备笋头NFC的基础上,以硫酸水解法进一步去除纤维中的不定形区,从而制备笋头CNC,并优化其制备条件。采用单因子和正交实验相结合的方法研究了硫酸浓度、反应温度、料液比和反应时间对笋头CNC得率和粒径的影响。优化后的笋头CNC制备条件为:硫酸浓度61%、反应温度40℃、料液比1:21(g/m L)、反应时间120 min。该条件下笋头CNC的平均得率为47.34%。(2)通过透射电镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)对硫酸水解法制备的笋头CNC进行观察,发现笋头CNC以针状形态存在,长度主要集中在40-190 nm之间,宽度主要集中在4-12 nm之间,纵横比约为1:16。Zeta电位分析结果表明,笋头CNC由于携带有硫酸根而具有负电荷,其Zeta电位为-34.3 m V,使其能够在水中保持良好的稳定性。热重分析结果表明,由于硫酸盐基团的引入,CNC的热稳定性较NFC有所降低。经过硫酸水解以后的笋头CNC仍保持纤维素Ⅰ型的特征,由于部分无定形区被酸解,其结晶度提升到78.87%。固体核磁的结果进一步验证了,通过硫酸进一步水解纤维的不定形区,降低了CNC的粒径,并提高其结晶度。纤维结构的变化导致了理化性质的变化,并影响其应用潜力。与笋头粗纤维(IDF)和笋头NFC比较,CNC表现出最高的持水力和膨胀力。CNC的水溶液表现出最优的稳定性,经过24h能保持悬浮液的状态。(3)以人体结肠癌细胞(Caco-2)为细胞模型,通过显微镜、MTT、流式细胞法研究不同浓度的CNC对细胞形态和活性的影响,通过Western blot、免疫荧光检测、RT-PCR等方法研究不同浓度的CNC对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。在细胞培养基中添加不同浓度的笋头CNC(0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L),并培养48h。从扫描电镜(SEM)和倒置显微镜中可以看出,不同浓度的笋头CNC对细胞形态没有影响,说明CNC的添加不会对细胞产生损伤和毒性作用。MTT比色法的结果表明,即使最高浓度的CNC(200μg/m L)仍未见对细胞活力的不良影响。流式细胞图表明,CNC对Caco-2细胞没有毒性也不会造成机械损伤,并能引起Caco-2细胞凋亡率的下降。采用免疫荧光法、Western blot以及RT-PCR检测,从Bax、Bcl-2、Caspases-3三个凋亡通路上的蛋白表达量和RNA转录情况分析,CNC能够增加Bcl-2蛋白的表达量,并抑制促凋亡基因Bax与凋亡关键基因Caspases-3的表达,从而减缓细胞的凋亡,增加细胞的存活率。综上所述,通过多种检测技术手段得到的实验结果均证明了笋头CNC对Caco-2细胞没有毒性作用。