研究背景支气管哮喘(Bronchial asthma, asthma)是由多种细胞和细胞成分参与的气道慢性炎症疾患.这种慢性炎症导致气道高反应性,通常出现广泛多变的可逆性气流受限。如果哮喘持续发展,气流受限可变为部分可逆。目前认为,这与气道重塑的发生有关。气道壁重塑伴有气道上皮增生、上皮下纤维肌化、气道平滑肌增生、微血管发生和腺体的肥大等结构改变。各种炎症介质及炎症细胞对气管反复损伤和机体对损伤性刺激的修复性反应引起的气管发生改变,组织结构重构。众所周知,气道平滑肌细胞(Human airway smooth muscle cell, HASMC)在哮喘气道重塑中发挥着重要的作用,被认为是哮喘气道重塑的关键细胞。当前的哮喘治疗药物,主要作用于慢性气道炎症,而气道重塑未给予足够重视。目前,抑制和减缓气道重塑成为一个新的研究方向,因此越来越多学者将HASMC作为抑制和减缓气道重塑的新靶点。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome ten, PTEN)是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,定位于10q23.3,由9个外显子组成,编码由403个氨基酸组成的蛋白。研究表明,PTEN在等子宫内膜癌、卵巢癌、大肠癌等多种肿瘤发生中起重要作用。近年来随着研究深入,发现PTEN对非肿瘤疾病如：心肌肥大,高血压动脉粥样硬化,支气管哮喘哮等疾病中也发挥重要的作用。PTEN可以通过阻断磷脂酞肌醇-3-激酶信号传导通路(PI3K/PKB/AKT信号通路)及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号传导通路(Ras-Raf-MEKI/2-ERKI/2信号通路)等抑制肿瘤细胞、心肌和血管内皮等细胞的增殖、迁移,促进细胞的凋亡。在致死性及非致死性哮喘中可见明显平滑肌细胞增生、肥大和平滑肌向气道上皮、内膜的迁移发生,这在气道重塑中起了重要的作用,使气道壁增厚,导致基础气道阻力增加和不可逆性气流阻塞的发生。这些都间接证明HASMC具有迁移的功能。虽然目前还缺乏HASMC向气道内膜直接迁移的证据,但有研究发现,在哮喘患者气道活检组织标本中,气道固有层内发现的肌纤维母细胞在显微结构、形态学和位置方面都与HASMC极其相似,提示肌纤维母细胞可能是HASMC迁移并转化而来。这种迁移与动脉粥样硬化时血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)的迁移相类似。而且有文献表明,PTEN的过表达能抑制基础和PDGF诱导的VSMC的增殖,迁移和存活。因此我们推理：PTEN可能对HASMC的增殖、迁移等的主要信号传导通路有类似地影响。本实验主要侧重于改变表达PTEN对HASMC迁移的影响。研究目的通过携带绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒载体体外转染人气道平滑肌细胞(Human airway smooth muscle cell, HASMC),使肿瘤抑制基因PTEN的过表达和RNA干扰表达,并以空载腺病毒(Ad-GFP)及空白组(DMEM)作为阴性对照,观察其对HASMC迁移的影响,并探讨其作用机制。材料与方法1、取南方医院胸外科同期做肺叶切除术患者的正常肺叶、段支气管标本,(经患者及家属同意)组织块贴壁法培养人支气管平滑肌细胞(HASMC),取第3-8代细胞,进行实验。光镜下观察和细胞免疫组化(α-actin)进行HASMC鉴定.2、实验分为四组：(1)利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-GFP-PTEN)转染HASMC,实现PTEN的过表达；(2)针对PTEN基因的腺病毒短发夹状RNA(shRNA)载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN)转染HASMC,实现PTEN的干扰表达；(3)以感染空载腺病毒(Ad-GFP)转染HASMC; (4)只加入无血清培养基的空白组(DMEM)作为对照。重组腺病毒感染HASMC:选择处于对数生长期的HASMC,加入用无血清的DMEM稀释的病毒液,置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中孵育,4h后补加含有血清的完全培养基,继续孵育24h后,更换完全培养基,通过在倒置荧光显微镜下观察病毒转染效果。并用流式细胞计数确立最佳转染复数(MOI, multiplicity of infection)。3、通过Transwell趋化小室和细胞划痕试验(Wound healing assay)检测四组(Ad-GFP-PTEN、Ad-GFP-shRNA-PTEN、Ad-GFP、DMEM) HASMC的跨膜迁移能力和横向迁移能力的变化。其中划痕实验测量HASMC距离应用图像处理软件Image J.4、Western blot法检测PTEN蛋白的表达和AKT、ERK1/2通路的活化情况,检测相应信号通路在细胞迁移中的蛋白表达的改变,并探讨其作用。并加入两通路的抑制剂(LY294002、U0126)作为阳性对照。5、应用SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析,用x±s对资料进行描述,用单因素方差分析进行统计处理,组间比较采用LSD法。如果方差不齐,应用方差近似检验,组件比较用Dunnett’s T3检验。选取检验水准a=0.05。图片处理使用Image J软件。结果1、应用倒置相差显微镜观察,HASMCs未汇合之前多呈梭形或多边形,内有1-2个细胞核。细胞汇合后部分区域细胞束状排列,呈典型“峰、谷”状。细胞免疫组化法检测平滑肌细胞表型标志物α-actin,光镜下可见α-肌动蛋白(棕黄色颗粒)在胞质内均匀分布。2、用空载病毒载体Ad-GFP转染HASMC,在25、50、100、150、200不同MOI条件下,24小时流式检测的转染效率在70%—99%之间,当MOI≥100时转染效率达到95%以上,趋于稳定。因此确定最佳感染复数为MOI=100。各组腺病毒均以MOI=100转染HASMC,48h后倒置显微镜下观察,阳性细胞的绿色荧光蛋白GFP表达满视野。3、Western blot免疫印迹法法检测PTEN蛋白的表达：转染Ad-GFP-shRNA-PTEN后,干扰组PTEN基因表达减弱；转染Ad-GFP-PTEN后,过表达组PTEN基因表达明显增强；而阴性对照组和空白对照组,PTEN基因的表达无明显变化。4、Western blot免疫印迹法法检测AKT、ERK蛋白的表达：与对照组相比,Ad-shPTEN组细胞p-AKT表达明显增高,而Ad-PTEN组细胞p-AKT的表达减少,p-AKT抑制剂LY294002作为抑制p-AKT的阳性对照,五组总AKT表达无明显差异;与对照组相比Ad-shPTEN组细胞p-ERK表达降低,但Ad-PTEN组p-ERK表达无明显变化,p-ERK抑制剂U0126作为抑制p-ERK的阳性对照,五组总ERK表达无明显差异。5、Transwell趋化小室法证明与空白对照组(DMEM)(393.78±28.46)和阴性对照组(Ad-GFP)(395.78±51.50)相比过表达组(Ad-PTEN)(147.89±32.83)能显著抑制HASMC的迁移活动(P=0.000)；而干扰组(Ad-shPTEN)(405.33±81.74)与两对照组(Ad-GFP、DMEM)相比细胞迁移活动没有显著增加,无统计学意义(P=1.000)；阴性对照组(Ad-GFP)与空白对照组(DMEM)两者相比,差异无统计学意义(P=1.000); PI3K/AKT通路抑制剂组(LY294002)(70.56±12.95)作为抑制HASMC迁移的阳性对照组与其他4组差异有统计学意义(P=0.000)；划痕修复法的实验结果与transwell法基本相同,再次印证了与两对照组相比,Ad-PTEN组(121.76±20.66)能抑制HASMC的迁移(P=0.000),而Ad-shPTEN组(236.47±55.14)细胞迁移活动没有显著增加(P=0.564vsAd-GFPP=0.229vsDMEM)而Ad-GFP组(225.79±29.52)与DMEM组(258.88±55.06)没有显著性差异(P=0.079),LY294002(81.17±14.40)组作为抑制HASMC迁移的阳性对照组与其他4组有显著性差异(P=0.000vsAd-shPTEN&Ad-GFP&DMEM, P=0.033vsAd-PTEN)结论本文通过腺病毒介导转染HASMC,使抑癌基因PTEN在细胞实现的过表达和干扰表达,探讨PTEN对HASMC的迁移的影响,并讨论其分子信号的转导通路,得出以下结论：1、本实验用transwell法和划痕法检测细胞的迁移结果表明,与两对照组相比Ad-PTEN组细胞的迁移也受到了明显的抑制,因此我们推断过表达PTEN基因能通过PI3K/AKT通路调节HASMC的迁移作用。2、在Ad-shPTEN组干扰PTEN基因表达,p-AKT与p-ERK1/2表达出现“分离”现象,即p-AKT增加,p-ERK1/2减少;而在Ad-PTEN组p-AKT减少,p-ERK1/2却没有改变。根据既往的文献,这是PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK两通路的相互联系或串扰,即Cross-talk现象