论文部分内容阅读
多倍体化是自然界中一种普遍的自然现象,是植物进化的重要动力。研究表明,70%以上的被子植物在进化过程中至少经历了 一次多倍体化。新形成的异源多倍体必须在两个不同的基因组之间建立外来细胞质和细胞核之间的相容关系,这就会导致基因组结构、基因表达和发育特征的快速变化。研究表明,不同科属植物间的多倍体化进化模式不尽相同。菊科是被子植物中最大的科之一,其倍性变化大,菊属（Chrysanthemum）及其近缘属植物的杂交-多倍体化现象较为普遍,为植物的多倍体化研究提供了有利的材料。本研究利用秋水仙素处理菊花脑与菊蒿的杂种获得了异源多倍体。为了进一步阐明这些植物的基因组进化过程,我们利用SRAP,MSAP和RNA-Seq技术研究了异源多倍体化后的基因组,DNA甲基化和转录水平变化。同时还根据转录组库中的TCP序列,对差异表达基因CnTCP4和CnTCP13进行了克隆和功能的初步研究。主要研究内容及结果如下:1.秋水仙素诱导菊花脑×菊蒿属间杂种,获得了异源多倍体。与杂种相比,异源多倍体的叶片长和宽变大,花序、舌状花和管状花变大,管状花数目增加。利用SRAP技术研究了异源多倍体化后的基因组变化,主要出现了两种类型的遗传变化:父母本条带的缺失和新条带的产生。对这些变化的条带进行分析,发现三个异源多倍体株系1/2/3中分别有84/84/85（84.0%/85.7%/85.0%）条条带的变化是杂交引起的,6/4/6（6.0%/4.1%/6.0%）条条带的变化是多倍体化引起的,10/10/9（10.0%/10.2%/9.0%）条条带的变化是杂交和多倍体化共同作用的结果。表明杂交在异源多倍体形成过程中起主要作用。杂种和异源多倍体丢失的84/84/85条条带中,46/46/47条来源于菊蒿,23/24/24条来源于菊花脑,杂种和异源多倍体都表现出偏母性。杂种的DNA甲基化水平在杂交过程中降低,染色体加倍后异源多倍体的甲基化水平有所上升,DNA甲基化升高条带数是下降条带数的两倍（51.5/25.7）。2.利用RNA-Seq技术研究了异源多倍体化后转录水平的变化。菊花脑、菊蒿、杂种和异源多倍体四个库分别产生73,990,84,846,81,603和81,107个Unigenes。杂种/异源多倍体与父母本差异基因以下调为主。杂种和异源多倍体的非加性基因以超亲现象为主,沉默的基因比激活的基因多。杂种与母本菊花脑共同表达的基因比杂种与父本菊蒿共同表达的多（15.7%vs 3.8%）,异源多倍体与母本菊花脑共同表达的基因比异源多倍体与父本菊蒿共同表达的多（16.4%vs 4.1%）。杂种与菊花脑的差异表达基因（DEGs）比例为32.4%,而与菊蒿的比例为40.6%。异源多倍体与菊花脑的DEGs比例为32.6%,与菊蒿的比例为40.8%。结果表明,杂种和异源多倍体基因表达都存在母本偏向性。菊花脑与杂种、异源多倍体共同表达的基因没显著差异（15.7%vs 16.4%）;菊蒿与杂种、异源多倍体共同表达的基因也没显著差异（3.8%vs4.1%）。杂种、异源多倍体与菊花脑DEGs没显著差异（32.4%vs 32.6%）;杂种、异源多倍体与菊蒿DEGs没显著差异（40.6%vs 40.8%）。结果表明,杂交在异源多倍体形成过程中起主要作用。异源多倍体的形成不是简单的杂交和多倍体化过程的相加,而是它们互相作用的结果。在异源多倍体化过程中,叶和花发育相关的转录因子表达水平发生了变化。3.从菊花脑中克隆得到差异表达基因CnTCP4和CnTCP13,均属于Clas3 Ⅱ类的CIN类基因,具有非典型的bHLH结构域。CnTCP4和CnTCP13均定位在细胞核。CnTCP4具有转录激活活性,进一步分段显示,转录激活区在其C端201～300多肽区域中;CnTCP13没有转录激活活性。CnTCP4在叶中的转录水平最高,其次是舌状花和管状花;CnTCP13在舌状花中的转录水平最高,其次是管状花和叶。外源施加6-BA后,CnTCP4和CnTCP13的转录水平均被显著抑制。4.与转空载体pESPM酵母菌株相比,转CnTCP4酵母菌株生长势明显减弱,外形出现异常,有25.65%细胞出现双核,细胞变长。表明CnTCP4抑制酵母增殖,促进酵母生长。在拟南芥中,超表达CnTCP4和CnTCP13后,植株和叶片都变小,成丛生状,莲座叶数目明显增多,抽薹时间推迟,花变大,花瓣变长。表明超表达CnTCP4和CnTCP13基因对拟南芥叶片生长有明显的抑制作用,对花瓣的伸长生长有明显的促进作用。RT-PCR分析结果显示,拟南芥中转CnTCP4后,AtCDKD;2基因在叶片中表达下调,AtCDKC;1基因表达上调;转CnTCP13后,AtCDKC;1、AtCYCL;1、AtCDKG;2和AtDPB基因在叶片中表达上调。5.利用CnTCP13从菊花‘神马’顶芽酵母cDNA文库中筛选出CnTCP2和CnF-box互作蛋白。CnTCP2和CnF-box均定位在细胞核,没有转录激活活性。酵母双杂交和双分子荧光互补实验证明,CnTCP2、CnTCP4和CnTCP13两两分别互作;CnF-box与CnTCP2和CnTCP4不互作,与CnTCP13互作。6.超表达CnTCP2拟南芥表型与超表达CnTCP13类似。RT-PCR分析显示,拟南芥中转CnTCP2后,叶片中AtCDKD;1和AtCYCB2;4基因表达下调,AtCDKC;1、AtKRP5和AtE2F3基因表达上调。超表达CnF-box拟南芥株系的植株变小,莲座叶变小且边缘向下卷曲,表明超表达CnF-box基因对拟南芥叶片生长也有明显的抑制作用。RT-PCR分析显示,拟南芥中转CnF-box后,叶片中AtCDKB2;2,AtCDC25和AtCYCB2;4基因表达下调。CnTCP2、CnTCP4和CnTCP13可能通过形成蛋白复合体促进AtCDKC;1基因的表达从而抑制叶片发育。