马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus, EIAV)是巨噬细胞嗜性的慢病毒。EIAV与其它慢病毒成员的基因组结构、生命周期及抗原漂移规律等相似,但EIAV基因组最小,同时遗传物质也最为简单。除编码Gag、Pol及Env等结构蛋白之外,EIAV仅编码Tat、Rev、S2、Ttm四种辅助蛋白。目前,对于EIAV编码蛋白的功能性研究多从病原学角度着手,而它们与宿主细胞因子相互作用方面的研究相对有限。EIAV感染后能引起马匹持续性感染,与其它慢病毒不同,90%的EIAV感染马匹能转归为无症状携带状态,这可能源于感染宿主细胞对EIAV复制的良好免疫控制。因此,EIAV成为研究如何实现对慢病毒感染和致病进行天然免疫控制的重要慢病毒模型。病毒感染宿主细胞后,可激活干扰素应答反应,诱导产生干扰素刺激基因(interferon stimulated genes, ISGs)。其中它们中的部分成员即为天然免疫限制因子。这些限制性因子分别作用于病毒生命周期的不同阶段,对逆转录病毒的侵入、复制和出芽存在限制作用,形成良好的种间屏障。但病毒在长期进化过程中利用自身编码蛋白克服这些限制因子的抗病毒功能。例如,TRIM5a可以特异性地与刚进入细胞的逆转录病毒核衣壳蛋白(CA)结合,从而通过干扰病毒脱衣壳过程,限制病毒复制。APOBEC3可组装至新生病毒粒子中,并在下一轮感染中诱导病毒DNA的超级突变,进而阻断病毒的复制,同时,HIV-1通过编码的Vif蛋白拮抗APOBEC3的抗病毒活性;tetherin主要通过干扰病毒粒子的出芽过程,发挥抗病毒活性,而HIV-1 Vpu蛋白具有克服tetherin限制作用的功能。目前,关于EIAV与宿主细胞蛋白之间相互作用的研究较少,仅有两篇文章研究报道了马APOBEC3对EIAV的限制作用的研究,但具体机制尚不明确。基于以上研究进展,本研究提出以下科学问题：1)马巨噬细胞内是否编码tetherin蛋白同系物,该同系物是否受干扰素的调控表达；2)马tetherin蛋白是否在马巨噬细胞内发挥限制EIAV感染的功能；3)马tetherin蛋白是否具有限制逆转录病毒出芽的能力,其发挥抗病毒的具体作用方式如何,关键功能域在哪?4) EIAV在与宿主细胞的相容共存中,采取怎样的策略拮抗马tetherin的抑制作用,究竟EIAV编码的哪个蛋白具有拮抗马tetherin的作用,其作用的分子机制是什么?针对上述问题,我们进行系列研究：首先,通过RT-PCR以及5’RACE技术,从马巨噬细胞中扩增获得马tetherin的核苷酸序列,同时对其氨基酸序列分析发现,马tetherin蛋白包含胞质尾区、跨膜区、胞外区、糖基磷脂酰肌醇锚定域等关键功能域,但其胞质尾区较其它物种tetherin蛋白的胞质尾区短。其次,通过荧光定量PCR技术对干扰素刺激前后马巨噬细胞、马皮细胞、马血管内皮细胞内tetherin mRNA的表达量进行监测发现,相对于马皮细胞、马血管内皮细胞,马巨噬细胞内tetherin mRNA表达水平较高,同时,用马干扰素刺激上述细胞后,tetherin mRNA的表达均有不同水平的增多,表明马tetherin为干扰素诱导型抗病毒蛋白。再次,通过siRNA干扰技术沉默细胞内源性tetherin蛋白的表达可促进EIAV在马巨噬细胞内的增殖；相反,在细胞中过表达马tetherin蛋白可有效的限制EIAV病毒粒子的出芽,而且马tetherin具有广谱性地限制HIV-1、SIV等其它病毒粒子出芽的功能;通过激光共聚焦及透射电镜观察发现,马tetherin蛋白通过将EIAV病毒粒子限定在细胞膜表面的方式发挥抗病毒功能;进一步通过定点突变技术发现,马tetherin的胞质尾区及糖基磷脂酰肌醇锚定域对其发挥抗病毒功能至关重要,有趣的是,研究发现糖基化修饰并不是马tetherin发挥抗病毒活性的关键因素。最后,通过Western Blotting及免疫共沉淀等方法首次证实,EIAV通过编码Env蛋白拮抗马tetherin的抗病毒活性,但EIAV Env蛋白不能有效拮抗人tetherin的抗病毒活性,EIAV Env蛋白的拮抗功能呈现种属特异性。进一步通过激光共聚焦观察发现,EIAV Env蛋白通过影响马tetherin转运的方式发挥拮抗作用。将人源、马源tetherin的功能域相互置换,我们发现EIAV Env通过靶向马tetherin的胞外区,从而将其隔离出EIAV出芽位点的方式发挥拮抗功能。综上所述,通过上述系列研究,本研究明确了马tetherin蛋白的抗病毒功能及作用方式;发现了EIAV拮抗马tetherin蛋白抑制其复制的作用模式,提出了EIAV与天然免疫限制因子tetherin的相互作用网络,为深入探讨EIAV与宿主细胞相互作用的天然免疫网络提供了直接证据。