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布鲁氏菌病（Brucellosis）是世界范围内流行的人畜共患传染病，可导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。尽管布鲁氏菌弱毒疫苗对布鲁氏菌病的控制发挥着重要的作用，但存在着安全性较差、副反应大等缺点。为此，本实验构建了表达布鲁氏菌外膜蛋白25（outer membrane protein，OMP25）基因的重组山羊痘病毒（recombinant goatpoxvirus，rGTPV），并对其免疫原性进行研究。
根据GenBank中登录的羊种布鲁氏菌OMP25基因序列及山羊痘病毒（goatpoxvirus，GTPV）转移载体PGM-TK-I1L-GPT1的外源基因插入位点设计扩增OMP25基因的引物P1、P2，并在上下游分别引入XhoⅠ酶切位点，以含有OMP25基因的质粒为模板通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增羊种布鲁氏菌OMP25基因。回收纯化后用T4DNA连接酶连于克隆载体PBS-T上，转化受体大肠杆菌Top10，蓝白斑筛选阳性菌落，酶切测序鉴定OMP25基因片段序列的正确性。再将正确序列的OMP25基因连接到GTPV载体PGM-TK-I1L-GPT1上，通过PCR、酶切、测序鉴定OMP25基因连接插入PGM-TK-I1L-GPT1后的序列和插入方向的正确性。用脂质体转染法将rGTPV载体与预感染GTPV疫苗株G14-STV44-55的绵羊成纤维细胞，在细胞内同源重组。通过霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）筛选、纯化，PCR鉴定重组山羊痘病毒。将重组病毒感染绵羊成纤维细胞，对细胞裂解物进行Dot-ELISA、Westen-blot试验，检测特异性表达情况。将rGTPV以1×107噬斑形成单位（Plaque forming unit，PFU）/每只小鼠多点皮下注射的小鼠作为试验组，以注射GTPV疫苗株G14-STV44-55和布鲁氏菌弱毒M5号苗的小鼠作为对照组，同时以注射PBS的小鼠作为空白对照组，分别对四个组的小鼠每隔7天免疫一次，连续免疫三次后采集血清检测IgG抗体水平。取rGTPV组和PBS空白对照组小鼠脾脏分离淋巴细胞通过OMP25蛋白刺激检测淋巴细胞增殖。最后取rGTPV组小鼠肝、肾做石蜡切片，观察重组疫苗对小鼠的安全性。
本实验成功的构建了携带布鲁氏菌OMP25基因的重组山羊痘转移载体PGM-TK-I1L-GPT1-025，与山羊痘疫苗株G14-STV44-55共转染绵羊成纤维细胞，在细胞内同源重组，通过MPA筛选成功获得羊种布鲁氏菌OMP25基因重组山羊痘病毒株G14-STV44-55-BOMP25。Dot-ELISA和Westen-blot免疫印记结果显示rGTPV株G14-STV44-55-BOMP25表达的蛋白能够被布鲁氏菌OMP25阳性血清识别。重组病毒稳定性试验也证明其在羊成纤维细胞上传10代其基因组仍能保持外源的OMP25基因。而且试验小鼠皮下注射重组病毒后，间接ELISA检测抗布鲁氏菌OMP25抗体和抗山羊痘病毒抗体IgG，结果经统计学分析rGTPV组与M5弱毒苗组比较差异显著（P<0.05），rGTPV组与GTPV组比较差异性不显著（P>0.05）。小鼠淋巴细胞增殖实验证明rGTPV在小鼠体内能够使淋巴细胞致敏，再次在布鲁氏菌OMP25抗原的刺激下能够诱导淋巴细胞的增殖。在rGTPV组小鼠肝、肾石蜡切片中未发现有病变特征，说明此重组山羊痘疫苗不对小鼠的肝、肾造成可见病理损伤。