脂肪组织中的炎症反应与肥胖相关性代谢综合症密切相关,而巨噬细胞则在调节脂肪组织的炎症反应中发挥关键作用。由于脂肪组织具有活跃的分泌功能,推测该组织可分泌蛋白来调控巨噬细胞介导的炎症。我们结合基因表达谱和生物信息学技术来研究前脂肪细胞(3T3-L1细胞)的分化过程,分别对前脂肪细胞(3T3-L1细胞)和成熟脂肪细胞进行了全基因组微阵列筛选,搜索在成熟脂肪细胞中的被诱导高表达的基因,并进行基因测序分析、预测信号肽以及编码蛋白,从而发现了巨噬细胞集落刺激因子诱导单核细胞活化的似过氧化物酶2(Peroxiredoxin(PRX)-like 2 activated in M-CSF stimulated monocytes,PAMM),PAMM是一个具有CXXC序列的含有类似过氧化物酶2结构域的蛋白,是一种新的分泌蛋白并具有强大的抗炎特性。PAMM是由成熟的人脂肪细胞分泌的蛋白。PAMM在白色和棕色脂肪组织中均高表达,并在肥胖状态时进一步表达增加。PAMM的过表达可明显抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的巨噬细胞炎症。用培养了脂肪细胞的培养液和抗PAMM的抗体孵育巨噬细胞,可显著增强LPS诱导的RAW264.7细胞的炎性细胞因子的表达。此外,用提纯的PAMM蛋白孵育RAW264.7细胞也有类似的抗炎作用。而且,在RAW264.7细胞中强制性过表达PAMM可导致LPS诱导的ERK1/2,p38MAPK和JNK的磷酸化的减少,这表明PAMM很可能是通过抑制MAPK信号通路从而发挥其抗炎的功能。失去抗氧化还原活性的PAMM CXXC结构的突变体仍可抑制LPS刺激的巨噬细胞产生炎性细胞因子的能力,这表明PAMM的抗炎特性可能并不依赖于其抗氧化特性。第一部分PAMM是来源于脂肪细胞的新型分泌蛋白目的:搜索在成熟脂肪细胞中的被诱导高表达的基因、预测信号肽并编码蛋白,确定PAMM是一种来源于脂肪细胞的分泌蛋白。方法:(1)3T3-L1细胞与DMI(地塞米松,甲基黄嘌呤,和胰岛素)孵育15天诱导分化为脂肪细胞。细胞用油红O染色进行分析,并采用Nikon显微镜系统拍摄细胞染色图像。对未分化的3T3-L1细胞以及脂肪细胞进行微阵列分析来比较基因表达谱并进行相关的基因测序分析。DMI诱导3T3-L1细胞分化期间,用Northern blot和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞内及培养液中PAMM的表达。(2)分别用Flag-PAMM质粒或Flag-MCPIP1质粒瞬时转染HEK293细胞,并进行Western blot检测,分析全细胞裂解液和培养基中的Flag-PAMM和Fl+ag-MCPIP1。(3)Northern blot分析小鼠组织中PAMM m RNA的表达。给一个月月龄的野生型C57/BL6小鼠饲喂高脂饮食四个月,收集高脂饮食喂养不同时间后小鼠的白色脂肪组织,进行Northern blot分析。结果:(1)3T3-L1细胞与地塞米松、甲基黄嘌呤、胰岛素的混合分化液(DMI)孵育后,能分化成为脂肪细胞。PAMM在脂肪细胞和在3T3-L1细胞中的表达相比上调8倍,核苷酸序列分析结果表明,PAMM包含一个开放阅读框,编码229个氨基酸的蛋白质。其蛋白质序列与过氧化物酶家族(Peroxiredoxins,Prxs)相似,并含有一个CXXC结构。3T3-L1细胞分化15天时细胞裂解液和培养液中PAMM水平均明显上调(P<0.05)。(2)Flag-PAMM和Flag-MCPIP1都出现在转染的HEK293细胞全细胞裂解液中,但只有flag-PAMM出现在培养基中。(3)PAMM m RNA在小鼠组织中广泛表达,但在脂肪组织中的表达最高。在小鼠高脂饮食诱导肥胖的过程中,肥胖小鼠的脂肪组织中PAMM m RNA的显著增加小结:(1)PAMM是一个具有CXXC序列的含有类似过氧化物还原酶2结构域的蛋白,3T3-L1前脂肪细胞的分化促进PAMM表达的上调。(2)PAMM是一个来源于脂肪细胞的新发现的分泌蛋白。(3)PAMM在小鼠白色和棕色脂肪组织中均高表达,并在肥胖小鼠的脂肪组织中进一步表达增加。第二部分PAMM显著抑制巨噬细胞炎性因子的表达及机制研究目的:观察PAMM对LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞炎性因子表达的影响,并探讨其机制。方法:(1)Flag-PAMM质粒或对照质粒瞬时转染RAW264.7细胞24小时,收集细胞裂解物进行Western blot检测;以磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered saline,PBS)或0.1μg/ml LPS处理转染后的RAW264.7细胞8小时,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time Quantitative PCR,q PCR)法检测RAW264.7细胞的炎性细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)的表达。(2)DMI孵育3T3-L1细胞15天,使之分化成脂肪细胞;收集分化好的3T3-L1脂肪细胞的裂解液及其细胞培养液,进行western blot分析。在上述实验获得的培养液中加入抗PAMM抗体(1.0 ng/ml)或Ig G预孵育1小时后,再孵育Raw264.7细胞1小时,然后用PBS或0.1μg/ml LPS处理8小时,采用q PCR法检测IL-1β、IL-6、IL-12和i NOS m RNA的表达水平。(3)Akata wash法提纯BL21大肠杆菌中PAMM蛋白。用0、0.1、0.5μg/ml纯化的PAMM蛋白孵育RAW264.7细胞30分钟,再用0.1μg/ml LPS刺激8小时。q PCR检测细胞IL-1β、IL-6、IL-12和i NOS m RNA的表达水平。(4)PAMM表达质粒或对照质粒瞬时转染RAW264.7细胞24小时,用0.1μg/ml的LPS处理0,15和60分钟。Western blot检测细胞裂解物中细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases,ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNKs)和IκB激酶β(Inhibit kappa B kinase beta,IKKβ)的总蛋白水平及磷酸化的情况。(5)PAMM表达质粒或PAMM C88G突变体(在CXXC结构的88位置上的半胱氨酸残基被甘氨酸取代)的表达质粒或对照质粒瞬时转染RAW264.7细胞24小时,用PBS或400μM过氧化氢处理2小时,测定细胞胞浆中还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)/氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)的比值。用PBS或0.1μg/ml的LPS处理上述转染细胞8小时,q PCR法检测细胞IL-6、IL-8和i NOS m RNA的表达水平。结果:(1)RAW264.7细胞被成功转染并过表达PAMM后,能显著减少由LPS诱导的炎性因子IL-1β、IL-6,IL-12和i NOS m RNA的表达(P<0.001)。(2)在分化好的脂肪细胞的裂解液及其细胞培养液中均有PAMM蛋白的表达,而培养液中的PAMM的作用被抗PAMM抗体中和后,LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β、IL-6、IL-12和i NOS m RNA的表达显著增加(P<0.001)。(3)提纯的PAMM蛋白能剂量依赖性地抑制LPS刺激的RAW264.7细胞的IL-1β、IL-6、IL-12和i NOS m RNA的表达(P<0.001)。(4)过表达PAMM显著抑制LPS诱导的Raw264.7细胞的ERK1/2,p38MAPK和JNK的磷酸化,而对LPS诱导的Raw264.7细胞的IKKβ的磷酸化则无抑制作用。(5)与过表达PAMM C88G突变体相比较,过表达PAMM则可显著阻止由H2O2所导致的GSH/GSSG比值的降低(P<0.001)。过表达PAMM和过表达PAMM C88G均可显著抑制LPS诱导的IL-6和IL-8的表达(P<0.001)。但与过表达PAMM不同,过表达PAMM C88G未显著抑制LPS诱导的i NOS的表达。小结:(1)PAMM对巨噬细胞炎性因子的表达具有显著的抑制作用。(2)过表达PAMM显著抑制LPS诱导的Raw264.7细胞的ERK1/2,p38MAPK和JNK的磷酸化,提示PAMM抑制LPS刺激的巨噬细胞的MAPK信号通路。(3)PAMM具有抗氧化应激的能力,提示PAMM是一个具有氧化还原功能的调节蛋白,它的CXXC结构对其抗氧化的能力是至关重要;PAMM抑制LPS刺激的巨噬细胞炎性细胞因子生产的能力与其抗氧化性能无关。结论1.PAMM是一个具有CXXC序列的含有类似过氧化物还原酶2结构域的氧化还原调节蛋白,是一种新型的脂肪细胞分泌蛋白;2.PAMM抑制LPS刺激的巨噬细胞炎性因子的表达与其抑制MAPK(ERK、P38MAPK、JNK)的活性有关,与其抗氧化性能无关。