人血白蛋白(Human serum albumin,HSA)是由健康人的血浆经低温乙醇分离提取并经病毒灭活后制成的生物制品,临床上用于出血性、外伤性体克、烧伤、肝硬化伴腹水和水肿、恶性肿瘤、肾病水肿等。目前国内企业采用低温乙醇法压滤工艺分离血浆蛋白,该工艺具有蛋白收率高,生产成本低,经济效益好,因而在工业化生产中大规模应用。然而低温乙醇法特异性不高,在生产的过程中不能完全除去杂蛋白成分,各企业的工艺参数也不尽相同,因此在终产品中会存在一定量的杂蛋白。据文献表明,制剂中存在的这些杂蛋白是引起的临床不良反应的主要原因之一[1],不良反应类型主要为全身过敏反应和多器官损坏,包括过敏性休克、热原样反应、肾脏损害等。因此探究血液制品中的未知蛋白可为临床不良反应提供参考,本课题旨在建立杂蛋白分离分析的方法并测定人血白蛋白制剂中的杂蛋白的组成,为各企业的生产工艺优化提供了数据支持,同时为产品的一致性评价奠定基础。为了初步了解各企业的杂蛋白含量和种类的差异,对五家企业近两年的批签发数据进行统计分析,共获得323批白蛋白制剂的纯度数据。结果显示,五家企业生产的白蛋白制剂纯度范围在96.2%~98.3%之间,企业间差异较大。其中A企业生产的制剂纯度较为均一,提示生产工艺较为稳定;B企业生产的制剂纯度较其他四所企业低,显示产品中存在一定量的未知蛋白。为了进一步分析各企业制剂的蛋白组成异同,对白蛋白制剂进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,初步探究其组成成分的异同,结果显示各企业间生产的白蛋白制剂差异较小,各企业制剂的杂蛋白有8~9条带。鉴于醋酸纤维素薄膜电泳与SDS-PAGE方法的局限性,不能特异性地鉴定出杂蛋白成分,本研究尝试建立未知蛋白谱鉴定方法,进而确定各企业生产的人血白蛋白制剂的未知蛋白组成。在建立质谱分析方法时,首先对供试品浓度进行选择,再对质谱鉴定参数进行优化。结果显示,白蛋白浓度超过5mg/ml时,超过仪器鉴定阈值,导致白蛋白主成分未能被成功鉴定,提示蛋白浓度不能过高。蛋白浓度在1mg/ml-2mg/ml时,主成分白蛋白肽图较为完整,但未知蛋白检出效率低;对白蛋白肽图中的肽段进行b/y离子连续性分析发现,蛋白鉴定得分大于150分,结果具有较高的可信度。以上结果提示主成分蛋白浓度过高,掩盖未知蛋白的的信号,未知蛋白的鉴定需要对未知蛋白进一步分离。结合前期结果,对各企业的白蛋白中未知成分进行分离纯化、酶切方法的优化,确立其分离纯化方法,并分析各企业未知蛋白的种类、数量、分子量、等电点分布及其工艺相关性。采用阴离子交换柱与凝胶过滤层析柱分别对白蛋白进行分离,结果显示,使用阴离子交换层析只能得到主成分单一峰,而使用凝胶过滤层析得三组峰,因此采用凝胶过滤层析对白蛋白中位置组分进行分离。采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分别对各分离组分进行酶切,结果显示,胃蛋白酶酶切结果重复性较差且蛋白得分较低,而使用胰蛋白酶重现性良好,蛋白鉴定得分较高。对胰蛋白酶酶切效果进行进一步确证,结果发现,三次平行实验,共有11个蛋白被检出,其中共有8个蛋白每次均检出,说明方法稳定性较好。最终采用胰蛋白酶对人血白蛋白中的未知蛋白成分进行鉴定,结果显示五家生产企业产品,除一家企业杂蛋白较少外,另外四家企业所有批次样品均含有载脂蛋白a-Ⅱ(apolipoproteina-ii)、人结合珠蛋白(haptoglobin)、人血色素结合蛋白(hempoexin)、α-1b-糖蛋白(alpha-1b-glycoprotein)、α-2-hs-糖蛋白(alpha-2hs-glycoprotein),且略有差异。对未知蛋白等电点进行分析发现,未知蛋白等电点与白蛋白较接近,可能在乙醇共沉淀时与白蛋白共同析出,初步可以说明未知蛋白为工艺相关蛋白;对未知蛋白分子量进行分析发现,未知蛋白以多聚体的形式存在于白蛋白中。以上结果表明,在临床应用中,应更加关注上述未知蛋白的过敏效应,在工业生产中,应优化生产工艺,尽可能去除无关蛋白,提高产品质量。本课题建立的白蛋白制剂杂蛋白质谱分析方法为探究临床不良反应提供了数据支持,为白蛋白制剂的一致性评价提供了新的方法,为血液制品的质量控制奠定了基础、提供了新思路。