论文部分内容阅读
非生物胁迫是影响作物生长发育、限制其产量的重要环境因子,作物如何应对非生物胁迫是世界性的研究课题。果聚糖的积累有利于增强植物对逆境胁迫的抵抗能力。小麦近缘属植物具有抗旱、抗寒、抗盐及耐瘠薄等优良特性。因此,克隆其果聚糖合成相关基因,鉴定其功能并进行小麦抗逆育种改良研究具有重要的理论和现实意义。转基因植物的载体骨架序列及抗性标记是转基因生物安全性争论的焦点,是限制转基因植物商业化的重要因素。基因枪介导的最小表达盒(目的基因和筛选基因)按一定摩尔比共转化受体材料可能是有效去除载体序列和标记基因的一种高效的遗传转化法。本研究以小麦近缘属植物华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)、簇毛麦(Dasypyrum villosum(L.)),大赖草(Leymus racemosus)、滨麦(Leymus mollis)为材料,利用genome walking结合RT-PCR技术克隆到华山新麦草和簇毛麦果聚糖-6-果糖基转移酶基因(6-SFT);利用RT-PCR结合RACE技术克隆到大赖草和滨麦6-SFT基因及华山新麦草、簇毛麦、大赖草果聚糖-1-果糖基转移酶基因(1-FFT),华山新麦草蔗糖-1-果糖基转移酶基因(1-SST),并对其进行基因结构和序列分析;以p1300-35SN为载体,构建植物表达载体p1300-35SN-FBEs。通过农杆菌介导法转化烟草,对转基因植株进行抗旱、抗寒和抗盐性鉴定,并测定与果聚糖含量相关的重要生理指标。以质粒pAHC25为参照,将质粒pAHC25和pEasy-Blunt-bar所对应的gus和bar基因的线性表达盒通过酶切消化并纯化回收,将bar或pAHC20与gus按摩尔比1:1、1:2、1:3平行地共转化普通小麦科农199幼胚,以期确定筛选基因与目标基因的最佳摩尔比,建立安全高效的基因枪介导的普通小麦表达盒共转化体系。本文得到的主要研究结果如下:1.分离到多种果聚糖合成酶基因:克隆到来自华山新麦草、簇毛麦、大赖草和滨麦的4个6-SFT基因,分别命名为Ph-6-SFT(1851 bp)、Dv-6-SFT(1863 bp)、Lr-6-SFT(1863 bp)和Lm-6-SFT(1866 bp);克隆到华山新麦草、簇毛麦、大赖草的3个1-FFT基因,分别命名为Ph-1-FFT(1989 bp)、Dv-1-FFT(1950 bp)和Lr-1-FFT(1989 bp);克隆到华山新麦草的1个1-SST基因,命名为Ph-1-SST(2001 bp);2.完成多个果聚糖果糖基转移酶基因载体构建:将Ph-1-SST、Ph-1-FFT、Dv-1-FFT、Lr-1-FFT、Ph-6-SFT、Dv-6-SFT和Lr-6-SFT基因分别插入到p1300-35SN载体获得7个基因的植物表达载体;3.果聚糖合成酶基因转化烟草及转基因植株的分子鉴定:将所构建的植物表达载体p1300-35SN-Ph-1-FFT/Dv-1-FFT/Lr-1-FFT/Ph-6-SFT/Dv-6-SFT/Lr-6-SFT通过农杆菌介导法转化烟草,经潮霉素筛选后每个载体分别获得113、98、101、65、69、72共518株转基因烟草植株,应用基因特异性引物对6个载体的转基因烟草植株进行基因组PCR、RT-PCR鉴定,每个载体分别获得64、53、55、24、38、43共277株转基因阳性植株。4.转基因植株抗逆性鉴定:表型分析结果表明,这些基因的表达都能够增强转基因烟草对旱、冷、盐胁迫的耐受能力。不同物种的6-SFT基因比1-FFT基因抗逆效果好,不同物种的同一基因抗逆性无明显差异。相比之下,Ph-6-SFT和Dv-6-SFT基因的抗逆效果较好。5.转基因植株生理指标的测定:生理指标测定结果表明,在旱及冷胁迫处理条件下,与转空载体的对照植株相比转Ph-1-FFT、Dv-1-FFT、Lr-1-FFT、Ph-6-SFT、Dv-6-SFT和Lr-6-SFT基因的阳性植株具有较高的果聚糖、可溶性糖及脯氨酸含量;较低的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量。旱或冷胁迫处理后的转基因植株果聚糖、可溶性糖和脯氨酸含量显著高于正常条件下转基因植株的果聚糖、可溶性糖和脯氨酸含量。旱和冷胁迫后转基因植株丙二醛含量增加不显著,而对照植株丙二醛含量显著增加。这些结果表明Ph-1-FFT、Dv-1-FFT、Lr-1-FFT、Ph-6-SFT、Dv-6-SFT和Lr-6-SFT基因的表达均能显著增强转基因植株果聚糖等渗透调节物质的积累从而使转基因植株能更好的抵抗旱和冷胁迫所致的氧化损伤。转不同基因的转基因植株各生理指标的比较结果表明,与1-FFT基因相比6-SFT基因对提高作物逆境胁迫抗性更有效。不同物种的同一基因各生理指标之间的差异不显著。相比之下,Dv-6-SFT和Ph-6-SFT基因对提高植物的抗旱、抗寒效果较好。以上试验结果表明Dv-6-SFT和Ph-6-SFT基因可应用到作物抗逆育种中。6.基因枪介导的最小表达盒共转化小麦最佳摩尔比的确立:基因枪介导的完整质粒或表达盒共转化普通小麦,除草剂草丁膦(phosphinothricin,PPT)筛选后共获得3964株T0代小麦抗性植株,PCR鉴定共获得70株推定的GUS阳性植株,GUS染色检测共获得56株阳性植株。转化效率统计结果显示,获得完整质粒的转基因植株11株,转化率为0.70%;gus+bar表达盒的转基因植株30株,转化率为0.16-1.03%;gus+pAHC20的转基因植株29株,转化率为0.09-0.98%。其中pAHC20/bar:gus摩尔比为1:2时转化率显著高于其他组合。Southern blot分析结果表明,gus基因已成功整合到小麦基因组中。表达盒共转化小麦最佳摩尔比的确立为普通小麦遗传转化果聚糖相关基因提供参考依据。7.将植物表达载体p1301-Ph-6-SFT/Dv-6-SFT通过基因枪介导的最小表达盒共转化法转化普通小麦科农199,对T0代植株进行抗性筛选、叶片GUS染色、gus基因的PCR检测,结果表明已成功将表达载体转入小麦基因组,并且确认各获得1株转基因阳性株系。