论文部分内容阅读
目的：本研究旨在利用RNA干扰技术研究MRE11沉默对肝癌耐药细胞Be17402／5-FUDNA损伤修复功能、化疗药物敏感性、耐药相关蛋白表达以及细胞生物学行为的影响,初步探索MRE11与肝癌耐药性的关系。方法：1.shMRE11干扰质粒的鉴定与扩增。2.BEL7402/5-FU和BEL7402细胞的培养及MTT法鉴定BEL7402／5-FU细胞的多药耐药性。3.shMRE11干扰质粒转染BEL7402/5-FU细胞并通过与pEGFP-N1共转染检测转染效率。4.Real-time PCR及Western blot分别检测MRE11mRNA及蛋白水平沉默效率。5.Western blot检测细胞γ-H2AX蛋白表达。6.EdU法检测细胞DNA合成。7.MTT法检测细胞对DDP、MMC、 ADM、5-FU化疗药物的敏感性。8.Real-time PCR及Western blot检测耐药相关蛋白MRP1mRNA及蛋白水平的表达。9.MTT法检测细胞增殖情况。10.流式细胞术检测细胞周期。11.AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果：1.测序鉴定结果显示shMRE11质粒插入序列正确。2.MTT检测结果显示BEL7402/5-FU细胞对5-FU、ADM、DDP、MMC耐药指数分别为11.09、2.05、2.74、2.41。3.经pEGFP-N1评估转染效率为47.5%。4. Real-time PCR及Western blot检测结果显示MRE11mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为78.0%、56.1%。5.Western blot检测γ-H2AX表达结果显示shMRE11实验组较对照组增加(P<0.05)。6.EdU检测结果显示shMRE11实验组DNA合成率较对照组降低(P<0.05)。7.MTT结果显示shMRE11实验组对DDP、MMC、ADM、5-FU IC50较对照组均降低(P<0.05)。8. Real-time PCR及Western blot对MRP1检测结果显示shMRE11实验组与对照组相比MRP1mRNA及蛋白水平表达均有所降低(P<0.05)。9.MTT细胞增殖检测结果显示shMRE11实验组与对照组相比细胞增殖速度减慢(P<0.05)。10.流式细胞术检测结果显示shMRE11实验组S期细胞比例较对照组减少(P<0.05)。11. AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果显示转染24h、48h和72h后shMRE11实验组的细胞凋亡指数增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：shMRE11干扰质粒能够有效抑制BEL7402/5-FU细胞中MRE11表达,使细胞DNA损伤修复能力减弱、提高细胞对化疗药物的敏感性、下调耐药相关蛋白MRP1的表达、抑制细胞增殖、减少S期细胞、促进细胞凋亡,在一定程度上能够降低细胞耐药性,而且其逆转耐药的机制还可能与下调耐药相关蛋白MRP1的表达、促进细胞凋亡等途径有关。