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目的:微血管仅由单层内皮细胞和基膜构成。血管内皮细胞间的紧密连接是决定毛细血管通透性大小的主要因素之一。许多疾病的病理过程均伴有血管内皮细胞损伤,血管通透性增高,导致血管渗出。其中以缺氧最为常见且最重要。肠系膜微血管丰富,对缺氧较敏感,因此探讨有效的抗急性缺氧脏器损伤的保护措施具有重要意义。通心络(TXL)为复方中药制剂。已有报道,通心络可以改善血管内皮细胞的功能,但是其分子机制还不清楚。研究发现,micro RNA-155(mi R-155)参与心血管疾病的发生发展。但是关于mi R-155在血管内皮细胞中的作用鲜有报道。本实验在整体和细胞水平研究通心络对急性缺氧诱导的肠系膜微血管渗出以及mi R-155表达的影响,探讨通心络调控mi R-155和内皮细胞紧密连接蛋白表达的分子机制。方法:实验动物随机分组为C57BL/6J急性缺氧组,C57BL/6J急性缺氧+通心络组和mi R-155-/-急性缺氧组。通心络组每天灌服通心络,C57BL/6J急性缺氧组和mi R-155-/-急性缺氧组每天灌服等量生理盐水。3天后,建立急性缺氧小鼠模型,倒置荧光显微镜观察肠系膜微血管渗出,并记录存活时间和呼吸频率。Real-time PCR检测人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)中mi R-155表达水平。Western blot和免疫荧光染色检测HCMEC紧密连接蛋白的表达。Western blot检测HCMEC和人血管平滑肌细胞(HVSMC)中p47、p22和HO-1表达。实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理,以均数±标准差(x_±S.D.)来表示,多样本均数两两比较采用单因素方差分析(one way ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1通心络改善急性缺氧小鼠的存活时间和呼吸频率急性缺氧状态下,通心络组C57BL/6J小鼠存活时间明显变长,为对照组的1.33倍,呼吸频率也明显放缓。mi R-155-/-组小鼠存活时间较对照组也有所延长,提示通心络提高急性缺氧小鼠的存活时间可能与下调mi R-155有关。2通心络抑制急性缺氧诱导的肠系膜微血管渗出尾静脉注射荧光标记的BSA(FITC-BSA),倒置荧光显微镜实时记录急性缺氧小鼠肠系膜微血管渗出情况。结果显示,通心络组肠系膜微血管渗出明显少于对照组,mi R-155-/-组的渗出也明显少于对照组。提示,通心络可能通过下调mi R-155减少急性缺氧导致的肠系膜微血管渗出。3通心络抑制TNF-α诱导的mi R-155表达为了验证上述推测,我们培养人心脏微血管内皮细胞(HCMEC),以TNF-α(急性缺氧会引起强烈的炎症反应)为诱导因素,观察不同浓度TXL对mi R-155表达的影响。结果显示,通心络可以显著抑制缺氧诱导炎症反应所引起的mi R-155表达。4 mi R-155能够调控HCMEC紧密连接蛋白的表达为了进一步观察内皮细胞中mi R-155和紧密连接蛋白的关系,Western blot和免疫荧光染色显示,过表达mi R-155能抑制紧密连接蛋白claudin1,beta-catenin和ve-cadherin在细胞膜上的定位,而敲低mi R-155则促进这些紧密连接蛋白在细胞膜上的定位。提示,mi R-155可以通过调节紧密连接蛋白的表达参与调节微血管渗出。5通心络能够逆转mi R-155调控的HCMEC紧密连接蛋白表达为了进一步研究通心络通过mi R-155调节紧密连接蛋白表达的分子机制,Western blot和免疫荧光染色检测紧密连接蛋白的表达和定位。结果显示,通心络预孵育后过表达mi R-155增加紧密连接蛋白在细胞膜的表达,而敲低mi R-155则减少紧密连接蛋白在细胞膜的表达。提示,通心络可以完全逆转过表达或敲低mi R-155引起的紧密连接蛋白在细胞膜上的表达和分布,进而影响微血管的渗出。6 mi R-155参与HCMEC的氧化应激进程为了明确mi R-155调节紧密连接蛋白的分子机制,我们进一步观察了mi R-155对HCMEC氧化应激的影响。Western blot结果发现过表达mi R-155能显著抑制p47和p22表达,促进HO-1的表达;而敲低mi R-155则促进p47和p22表达,抑制HO-1的的表达。提示,过表达mi R-155诱导HO-1的表达促进氧化应激反应,但与p47和p22信号通路蛋白的表达增加无关。7通心络能够逆转mi R-155引起的HCMEC HO-1表达我们进一步研究发现,通心络预孵育后,过表达mi R-155能促进p47和p22表达,抑制HO-1的表达;而敲低mi R-155则抑制p47和p22表达,促进HO-1的的表达。提示,通心络可以通过mi R-155调节HCMEC的p47、p22和HO-1的表达。8通心络调节HVSMC HO-1的表达与mi R-155无关为了研究通心络对血管平滑肌细胞是否也具有上述作用,我们用人血管平滑肌细胞(HVSMC)重复上述实验。Western blot结果显示,过表达mi R-155促进p47、p22和HO-1在HVSMC中的表达。当给予通心络预孵育后不能逆转p47、p22和HO-1的表达。提示,通心络逆转mi R-155对HCMEC中上述几种蛋白表达的作用具有内皮特异性。结论:1通心络改善急性缺氧小鼠的存活时间和呼吸频率,并且抑制肠系膜微血管渗出与下调mi R-155的表达有关2通心络能够逆转mi R-155调控的HCMEC紧密连接蛋白表达3通心络能够逆转mi R-155的功能与调控HO-1表达有关