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单分子检测(single-molecule detection, SMD)是一种在单分子水平获取信息的研究手段。通过对单个分子进行研究,可以揭示分子之间被宏观所掩盖的微小差异。SMD可以在单分子水平上研究生物分子的构象变化、动力学、分子之间的相互作用、单分子操纵以及单分子定量检测。单分子定量检测是分析化学的最终目标。在单分子定量检测中最常用的是单分子计数法。该方法具有高检测灵敏度、高分辨率等优势。与传统的依据强度进行定量的方法相比,单分子计数是根据目标分子的个数进行定量,更适宜于超低浓度下生物分子的定量检测。MicroRNA(miRNA)的表达已经被证明和大多数癌症如乳腺癌、甲状腺癌、直肠癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等的监管和发展有关。监测miRNA生物标志物的变化能够用于预示疾病的早期状态。但是,对miRNA的定量检测总是因为它们的小尺寸、序列的相似性和相关的在细胞中的超低表达而十分棘手。因此,需要发展一种可以对miRNA进行灵敏和特异性检测的方法。近年来,随着DNA纳米技术的不断发展,研究者们以DNA链为原料,通过碱基之间的互补配对构建出了许多二维和三维的结构DNA纳米材料,并且开始把这些材料利用到生物传感和纳米器械等领域。这些结构DNA纳米材料的发展也为分析化学的发展提供了有力的工具。基于上面的论述,本论文组装了一种基于DNA四面体的新荧光纳米探针用于蛋白质的单分子检测并且构建带有toehold发卡的DNA四面体基底用于单个miRNA的灵敏、特异性检测。本论文共分为三章：第一章为绪论部分,主要介绍了单分子检测和单分子定量检测的背景、检测意义、检测原理、常用的检测方法,系统的分析了利用荧光成像技术进行单分子定量检测时常用的荧光探针存在的一些不足之处以及在基底上进行单分子检测时非特异性吸附的影响。此外还介绍了miRNA的一些常用的检测方法以及结构DNA纳米材料的发展及其在生物传感方面的应用。在第二章中,设计了基于DNA四面体的新荧光纳米探针,并成功用于蛋白质的单分子定量检测。该DNA四面体纳米探针在单分子检测中的使用,通过防止自猝灭和增加荧光强度和光稳定性,克服了有机染料的不足,避免了量子点的生物毒性和眨眼现象。在利用该荧光探针结合荧光单分子计数法对人IgG的定量检测时,得到的线性范围为3.0×10-14mol L-1-1.0×10-12mol L-1,相关系数为0.9997,方法的相对标准偏差为5.09%(n=3)。同时方法还显示了很好的特异性和较低的基质效应。在第三章中,设计了带有toehold发卡的DNA四面体基底用于灵敏和特异性检测miRNA。在基底上加入目标miRNA之后,通过toehold介导的链置换反应打开发卡,再与信号探针结合可进行单分子计数。而和目标miRNA序列高度相似的错配miRNA则不能打开发卡,或者打开发卡的速度很慢,通过控制反应时间,可以实现对目标miRNA的灵敏和特异性检测。论文中对构建的基底进行了一系列的表征,并且优化了反应时间和toehold碱基数(5nt、6nt、7nt和8nt)。当toehold部位为6个碱基时,对miRNA的检测具有最好的特异性。