HIF-1α在胃癌细胞上皮间质转化中的作用及金龙蛇颗粒干预研究

来源 :第二军医大学 中国人民解放军海军军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ldw521
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胃癌是常见的恶性肿瘤之一.在中国,其发病率在所有肿瘤中居第二位[1],且趋势逐年上升.大多数胃癌患者具有不明显的早期症状,等到确诊时已然处于中晚期阶段.尽管不断提高的诊疗手段的被日益应用,相对而言,疗效的进步却不令人满意,总体5年生存率偏低.大规模临床报道证实,胃癌原发病灶的侵袭和进一步转移是导致患者生存质量下降及生存时间缩短的主要原因[2].中医药作为胃癌治疗的重要辅助手段,探讨其对胃癌侵袭转移的抑制作用具有现实意义.魏品康教授根据四十余年临床经验,提出"痰浊内蕴"是胃癌的主要病机.在此基础上,自创金龙蛇制剂(包括颗粒及口服液)用于胃癌防治,临床疗效显著,能改善患者症状,延长患者生存期,提高中晚期患者生活质量;实验研究亦证实该药可抑制胃癌侵袭转移.  目前学术界已经公认细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤侵袭转移重要前提;肿瘤处在的缺氧微环境能够通过其主要效应分子HIF-1α促进肿瘤的侵袭转移,但HIF-1α与EMT之间的关系仍需阐明.目前研究已经通过体外实验在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等肿瘤细胞中证实了二者之间的相关性,但在胃癌细胞中尚未见明确报道,值得进一步探讨.  目的:  通过化学缺氧诱导剂氯化钴(CoCl2)体外模拟胃癌缺氧微环境,研究该环境中主要效应分子HIF-1α与胃癌细胞EMT发生的关系;在明确二者之间关系的前提下,探讨在缺氧环境中,金龙蛇颗粒是否通过调控HIF-1α,影响胃癌细胞EMT,最终干预胃癌细胞侵袭转移的目的.  方法:  实验共分为三个部分.第一部分:胃癌BGC-823细胞缺氧条件探索;第二部分:特异性沉默HIF-1α的胃癌BGC-823细胞的建立;第三部分:HIF-1α对胃癌BGC-823细胞上皮间质转化的影响及金龙蛇颗粒干预研究.  第一部分:根据前期研究选择胃癌BGC-823细胞进行常规复苏传代,并进行低氧造模:终体积每1ml细胞培养液中加入不同体积CoCl2溶液(0μ1、l0μ1、15μ1、20μ1)配制成不同终浓度CoCl2溶液(0μmol/L、l00μmol/L、150μmol/L、200μmol/L).观察细胞出现消化传代贴壁后,将不同浓度CoCl2的培养液加入,常氧条件下继续培养,分别在不同时间点采用MTT检测细胞存活率,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达.  第二部分:针对胃癌BGC-823细胞进行特异性HIF-1α基因沉默,分别用Western blot及RT-PCR检测转染后细胞中HIF-1α蛋白及基因表达情况.  第三部分:制备金龙蛇颗粒含药血清.金龙蛇颗粒药物组成:制南星、制半夏、山慈菇、全蝎、蜈蚣、壁虎、蟾皮、鸡内金、甘草等.SD大鼠分为空白血清组及中药血清组,前者予生理盐水,后者予金龙蛇颗粒浸膏21.36g/kg灌胃,2次/天,5天后摘眼球取血.  依据第一部分中CoCl2溶液作用浓度及时间,将细胞分为七组:a.常氧对照组:普通培养基培养处理;b.缺氧对照组:普通培养基+CoCl2培养处理;c.阴性对照组:转染阴性siRNA的细胞+CoCl2培养处理;d.RNAi组:转染siRNA-732序列的细胞+CoCl2培养处理;e.空白血清组:含空白血清的培养基+CoCl2培养处理;f.含药血清组:含金龙蛇颗粒药物血清培养基+CoCl2培养处理;g.RNAi+含药血清组:siRNA+金龙蛇颗粒药物血清的培养基+CoCl2培养处理.  倒置光学显微镜下观察各组细胞形态改变;Western blot检测各组细胞HIF-1α、E-cad、N-cad、Vimentin蛋白的表达;RT-PCR检测各组细胞HIF-1α、E-cad、N-cad、Vimentin基因的表达;Transwell小室检测各组细胞侵袭迁移.  结果:  1、合理选择CoCl2溶液作用浓度及时间,模拟细胞缺氧微环境.根据MTT法及Western blot检测HIF-1α蛋白表达,证实最终结果采用的是150μmol/L CoCl2作用12h,既能对缺氧环境进行有效模拟,又不对细胞活力产生明显影响.  2、RT-PCR检测mRNA结果表明,三条siRNA序列对HIF-1α基因均能够有RNAi作用,效果最佳的为732序列:5-CCAAGGAUGCUGGCACUAUTT-3,与阴性对照组(转染对照siRNA组)及缺氧对照组相比,HIF-1α蛋白及mRNA表达差异均具有统计学意义(p<0.01).  3、从形态上来说,缺氧对照组排列松散,胞体狭长;常氧对照组排列紧密,细胞铺路石般表现;含药血清组、含药血清+RNAi组、RNAi组细胞形态较缺氧对照组规则,上皮样细胞为主.  对于上皮细胞标记物E-cad来说,其表达为常氧对照组最高,缺氧对照组最低,含药血清组、RNAi组、RNAi+含药血清组介于二者之间;对于间质标记物N-cad、Vimentin而言,其表达与E-cad的表达相反.上皮、间质标记物的检测结果都表明常氧对照组与缺氧对照组比较差异有统计学意义(p<0.05),空白血清组与缺氧对照组相比差异无统计学意义(p>0.05),RNAi+含药血清组与缺氧对照组相比差异显著(p<0.01),其余各组与缺氧对照组相比差异有统计学意义(p<0.05);RNAi+含药血清组、RNAi组、含药血清组三组之间两两比较差异有统计学意义(p<0.05).  HIF-1α表达与N-cad、Vimentin表达略有不同,RNAi组与RNAi+含药血清组比较无统计学意义(p>0.05);但这两组分别与含药血清组比较有统计学意义(p<0.05).  Transwell小室检测细胞侵袭迁移结果与检测EMT的上皮、间质标记物表达结果基本一致.  结论:  1、缺氧环境中胃癌细胞较常氧环境中胃癌细胞更容易发生EMT.  2、从胃癌细胞EMT的角度探讨抑制胃癌侵袭转移的可能性,进一步完善导师提出的胃癌痰证理论.  3、通过RNAi技术对胃癌BGC-823细胞实现了HIF-1α基因的特异性沉默.  4、在缺氧环境中,HIF-1α基因特异性沉默可逆转胃癌细胞EMT,抑制胃癌细胞侵袭转移.  5、在缺氧环境中,金龙蛇颗粒药物血清能降低胃癌细胞HIF-1α蛋白的表达.  6、在缺氧环境中,金龙蛇颗粒药物血清能逆转胃癌细胞EMT,抑制胃癌细胞侵袭转移,这一过程与影响HIF-1α的表达相关,金龙蛇颗粒药物血清与RNAi共同作用时效果最明显.  7、从蛋白、基因、分子、细胞等不同角度为"从痰论治胃癌"提供新的实验依据.
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