单功能烷化剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是一种在实验室中普遍使用的模式化学诱变剂和致癌剂，用于研究环境中广泛存在的N-亚硝胺类诱变剂和致癌剂的致癌机制。它能和DNA及蛋白质等生物大分子形成加合物(adduct)，这些加合物最终可能导致染色体异常，点突变和细胞死亡。其引起的与突变有关的主要DNA损伤类型是O~6-甲基鸟嘌呤，这种损伤与许多肿瘤的发生密切相关。此外，环境诱变剂引起的突变也可发生在非DNA损伤部位，即非定标性突变(nontargeted mutagenesis)。我们实验室就曾用一个特殊的突变检测系统直接证明了低浓度(0.2μM)的短寿烷化剂MNNG(半寿期为1.1hr)可在哺乳动物细胞中诱发非定标性突变，且这种非定标性突变依赖于基因表达的改变。本实验室还证明了在低浓度MNNG处理下发生了广泛的细胞反应：DNA复制保真度的下降和DNA聚合酶谱的改变；细胞信号转导通路cAMP-PKA-CREB和JNK／SAPK被激活；细胞表面受体如表皮生长因子受体EGFR、肿瘤坏死因子受体TNFR发生聚簇；EGFR信号通路发生阻断；内质网应激反应的发生等。为了进一步了解化学致癌物诱发哺乳动物细胞应答反应的全貌，本实验室还利用了高通量的蛋白质组学技术对低浓度MNNG处理后细胞基因表达谱的改变进行了初步研究。结果发现有60多个蛋白斑点发生了变化，其中有36个被成功鉴定。这些被鉴定蛋白的功能涉及非常广泛，更提示了我们细胞应答反应的复杂性。同时我们考虑到细胞的应答反应往往是连续的、动态的，如果我们只孤立地研究某个作用点时的反应情况可能是不够的，因此进行不同浓度的量效研究和不同时间的时效研究就显得十分必要了。主要结果：1．在本研究中，我们首先根据已有的研究成果和相关文献确定了低(0.25μM)、中(1μM)、高(10μM)三个不同的MNNG处理剂量，经蛋白质组学的大规模筛选后发现共有85个蛋白斑点发生了显著的变化，并且成功鉴定了其中的71个，鉴定成功率为83.5％。这些蛋白的功能涉及转录调控、信号转导、代谢、DNA修复和细胞周期调控等。我们发现，在这些得到成功鉴定的蛋白中，仅有少数的蛋白在不同浓度MNNG处理后都有表达水平的改变，其它绝大多数蛋白表达水平的改变在不同浓度组是相对独立的。这说明处理剂量与效应之间并不是单纯的线性关系，高浓度处理组并不是低浓度处理组的简单放大。此外，值得注意的是随着处理浓度的增高，表达上调蛋白的比例减小，而表达下调蛋白的比例却增加。我们认为这和处理浓度增高后细胞毒性作用的增强是密切相关的。2．经过量效研究后，我们选择了对细胞毒性作用相对较小而细胞反应相对较明显的中浓度(1μM)处理剂量进行下一步的时效研究。选择MNNG处理后分别恢复3小时、12小时和24小时的细胞展开了蛋白质组学的分析。结果找到了78个差异表达点，其中的64个蛋白点得到了鉴定，鉴定成功率为82％。为了尽可能多的鉴定差异表达蛋白，我们又运用了合作研究的成果——微流控固相萃取(solid-phase extraction，SPE)装置，将鉴定成功率提高到了90％。这些得到成功鉴定的蛋白质的功能主要涉及细胞周期调控、代谢和信号转导等。从结果中看，差异表达蛋白的数量在12小时组达到最多，而24小时组不仅数量最少而且改变的幅度都比较小。这说明细胞对环境有毒刺激的应激反应可能主要集中在12小时左右或以内，在此后更长的时间(如24小时左右)细胞已经逐渐恢复并度过应激状态了。3．结合低浓度MNNG处理细胞后培养上清的蛋白质组学分析结果，我们发现核型dUTP焦磷酸酶蛋白在细胞裂解总蛋白的差异蛋白图谱中发生下调，同时又出现在细胞外液中。结果的准确性经Western blot方法证明。提示该蛋白可以作为监测人群接触环境致癌物后有效的早期生物标记物。4．由于细胞在应对环境有害因素刺激时很多信号转导通路的激活及重要反应事件的发生都要通过细胞核，所以细胞核内蛋白的改变也是我们关注的重点之一。由于细胞总蛋白提取液中含有的大部分是胞浆内的可溶蛋白，而核蛋白因为相对丰度较低可能覆盖不全，因此我们又分析了低(0.25μM)、中(1μM)浓度MNNG处理后细胞核蛋白的差异图谱，并且采用了准确性更高、上样量更低的荧光差异双向凝胶电泳(2-D DIGE)技术。经过比对，我们发现共有24个蛋白点的含量发生了改变，其中18个蛋白点被成功鉴定。这些蛋白大部分属于14-3-3蛋白家族、异质性胞核核糖核蛋白(hnRNPs)家族和结构蛋白家族。值得一提的是，尽管低、中浓度MNNG处理后细胞总蛋白的差异图谱中共同的蛋白很少，但在核蛋白的研究中却发现24个差异蛋白点中有10个蛋白是相同的，这提示我们低、中浓度MNNG处理后细胞发生的核内事件中有共同之处。5．差异表达蛋白质的Western blot验证：从成功得到质谱鉴定的蛋白质中，选择RanGAP1、14-3-3β和14-3-3ε进行Western blot验证。结果表明Western blot分析得到的结果与蛋白质组学的结果基本一致，说明本实验中蛋白质组学的分析结果是可信的。主要结论：1．通过对暴露于化学致癌剂MNNG后哺乳细胞量效及时效反应的蛋白质组学研究，分别发现了85个和78个蛋白的表达量发生了改变，说明MNNG作用后细胞内发生了广泛而复杂的变化，有众多蛋白参与了应答反应，这些蛋白涉及到细胞的不同功能。2．研究发现仅有极少数蛋白有剂量依赖关系和时间依赖关系，说明不同浓度MNNG暴露及暴露不同时间后细胞应答反应机制是不一样的，高浓度MNNG作用后，细胞应答反应体系不是低浓度作用后的简单放大，存在更为复杂的致毒机制；不同浓度MNNG作用不同时间后，可能先后依次激活细胞内的不同通路来诱发其应答反应和产生毒性效应。3．结合低浓度MNNG处理细胞后培养上清的蛋白质组学分析结果发现的核型dUTP焦磷酸酶蛋白，可以作为监测人群接触环境致癌物后可能的早期生物标志物。4．对低、中浓度MNNG处理后细胞核蛋白差异图谱的进一步分析发现，14-3-3蛋白家族和异质性胞核核糖核蛋白(hnRNPs)家族发生了较为明显的改变。并且两个浓度的核蛋白差异图谱具有较大的相似性，这提示我们低、中浓度MNNG处理后细胞发生的核内事件中有共同之处。