利用基因工程技术生产生物素是国际上高技术竞争的又一热点。由于生物素能够提高家畜胴体质量和改善肉质，提高家畜繁殖力，是家畜品种性能正常发挥所必需的物质。目前，生物素只能通过化学合成方法获得，且均从国外进口，价格昂贵，制约了我国畜牧科技和产业的发展。随着基因工程技术的兴起，人们开始转向生物素生物合成的研究。生物合成方法可以进行生物素的专一性合成，克服了化学合成法收率低，不能专一性合成，需经高成本化学拆分过程才能获得d-生物素的弊端，可使生物素的生产成本降低，从而提高畜牧业的经济效益。我国尚无这方面的研究，因此，开展本研究具有重要的理论意义和经济价值。 本研究以枯草杆菌ASl.1094菌株为研究材料，克隆了生物素操纵子基因，并对基因序列进行改造。而后对改造后的生物素操纵子基因进行了功能表达检测及bioW与bioB基因的诱导表达。旨在探索如何提高生物素操纵子基因的表达效率，为该操纵子基因的高效表达提供可行的研究路线和理论依据。并构建了可商业化操作的研究素材，为以后的研究提供探索性经验。本论文主要作了以下几方面的研究： 1．大片段基因组DNA的提取 为了获得用于PCR扩增(长距离PCR扩增和分段PCR扩增)的高纯度、大片段(至少为PCR产物长度的4倍)的DNA模板，应用三种方法：低熔点琼脂糖包埋法，SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提法和细菌基因组DNA提取试剂盒法，分别提取获得了枯草杆菌基因组DNA，并对3种方法的操作程序进行了不同程度的改进，结果表明：低熔点琼脂糖包埋法提取的基因组DNA片段明显大于后两种方法，采用0.5％琼脂糖凝胶电泳3h，仍然跑不出加样孔。将该方法提取的基因组DNA稀释100倍作为模板，采用长距离PCR方法，获得了枯草杆菌生物素操纵子基因全长。说明以低熔点琼脂糖包埋法提取枯草杆菌基因组DNA，并获得较大的DNA片段，是完全可行的。 2．枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆 将枯草杆菌基因组DNA稀释后，通过PCR反应条件的优化，分别扩增得到了生物素操纵子基因的长距离PCR产物(10.3kb)和3个分段PCR产物。而后采用TA克隆方法，经PCR产物的纯化、两端加A、pGEM-T载体连接、转化大肠杆菌、阳性克隆的酶切鉴定及重组质粒测序，分别获得了生物素操纵子基因3个片段(bio-1、bio-2、bio-3)的克隆质粒。应用分子生物学软件对测序结果进行了分析，并与Genebank中枯草杆菌168菌株的生物素操纵子基因序列进行了对比分析：共有12个碱基差异，且7个碱基导致了氨基酸变异，但未出现移码突变现象。 利用长距离PCR扩增引物为测序引物，利用PCR产物直接测序法，在长距离PCR产物两侧各测了1个反应，并与Genebank中168菌株序列进行了对比分析：两个菌株的序列基本吻合，只有1个碱基的差异。 通过2种方法对3个基因片段的转化效率比较和质粒浓度的测定(重复多次)，结果表明:biow基因作为大肠杆菌的外源基因，插入高拷贝的pGEM一T载体中，重组后的质粒具有不稳定性。 3.枯草杆菌部分基因组文库的构建及筛选 首先，通过对枯草杆菌生物素操纵子基因序列和基因组序列的分析，选择刀。脚Hl和KPnl位点。用这2个内切酶分别将基因组DNA和BluescriPt SKM13载体完全酶切消化，分别纯化回收(酶切的基因组DNA回收4.3一7kb间的片段)，并用几DNALigase连接，转化大肠杆菌DHS。。 应用PCR快检法对构建的枯草杆菌部分基因组文库进行了筛选，共检测了250个菌落，得到了3个阳性克隆子，经酶切鉴定和测序，获得了生物素操纵子5.Ikb的BamHI一KPnl亚克隆片段。测序结果表明:ASI .1 094菌株与168菌株bioAFDB基因序列完全一致，9个差异碱基是由于PCR扩增导致的。 枯草杆菌生物素操纵子基因4个亚克隆序列的测序结果证实，ASI .1 094菌株和168菌株生物素操纵子基因序列是完全一致的(见附件1)。 4.枯草杆菌生物素操纵子基因序列的改造 基因序列改造的关键是删除bioB与biof基因间的终止子，在Bowe:等(1 996)[’97]序列研究分析的基础上，设计一对PcR引物，以bi。一2片段克隆质粒为模板，采用Skip PCR方法，得到了约4.3kb产物，以TA克隆方式，插入pGEM一T载体中。将经鉴定的阳性克隆质粒进行测序，结果表明:bioB与biol基因间的5 lbp的终止子序列已被删除。在基因序列分析的基础上，采用特征酶酶切的方式，还删除了生物素操纵子基因上、下游与生物合成无关的序列。并将改造后的枯草杆菌生物素操纵子基因的3个片段依次插入pGEM一T载体中。并经binw、bioB及biol基因3’端的引物进行PCR扩增和重组质粒酶切鉴定而得到证实。 5.改造后的生物素操纵子基因的功能表达检测及biow和 bioB基因的诱导表达 为了检测改造后的生物素操纵子基因是否能够正常表达，我们利用生物素是细菌生长的必需物质这一特点，用4种大肠杆菌生物素缺陷株(R874、R875、R877、R879)经遗传互补分析表明:改造后的生物素操纵子中的bioA、binF、bioD、bioB4个基因均能够表达。因此，bioB与biof基因间终止子序列的删除，不影响基因的表达。 同时也证实，虽然所克隆的枯草?