围产期和泌乳前期的高产奶牛由于生理的变化和高的代谢水平,抗氧化功能显著降低,容易诱发氧化应激,导致疾病易感性增加。奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)是乳脂和乳蛋白合成与分泌的重要场所,其细胞的生物合成能力决定了奶牛乳腺的产奶能力。因此,深入研究硒(Se)减缓BMEC氧化应激的机理对科学合理的补加Se,缓解奶牛氧化应激,优化奶牛抗氧化防御能力具有重要的理论与实际意义。本论文以BMEC为细胞模型,分别以外源性一氧化氮(NO)诱导细胞氧化损伤、以二硝基氯苯(DNCB)抑制硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性并诱导细胞氧化损伤、以白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)抑制白介素-1(IL-1)生物活性、以丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制剂抑制其磷酸化水平、并结合过表达技术对TrxR1进行过表达,从TrxR1/MAPK/NO途径深入研究了 Se缓解BMEC氧化损伤的可能机制。本论文共分为6个试验。试验1采用单因子完全随机试验设计,研究不同剂量的Se(0、10、20、50、100、150、200 nmol/L)对BMEC抗氧化功能的调节作用,初探正常生理条件下Se对TrxR活性和NO合成的影响,为进一步探讨其促进机理提供基础。结果表明,Se对BMEC的相对增殖率(RGR)、TrxR、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性及其基因表达、超氧化物歧化酶(SOD)活性与总抗氧化能力(T-AOC)的促进作用,以及对丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)的抑制作用呈显著的剂量依赖效应,即Se对BMEC的抗氧化功能的促进作用呈剂量依赖性。综合多项指标得出,以50 nmol/L处理组较好,100～200nmol/L处理组促进作用削弱。然而,Se的添加对正常BMEC的炎症细胞因子IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及诱导性一氧化氮合酶(iNOS)活性及其基因表达、NO含量、核转录因子E2相关因子2(Nrf2)的基因表达无显著影响。试验2采用完全随机试验设计,以RGR、抗氧化及炎症因子等指标为判断指标,研究不同浓度的 NO(0、250、500、750、1000、1250、1500μmol/L),分别作用 2、4、6、8、12和24 h,筛选出适宜的NO氧化损伤建模浓度及作用时间。结果显示,过量的NO可诱导BMEC的氧化应激,以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)作为外源性NO,处理浓度为1000 μmol/L作用时间为6h,RGR降低至76.61%,引起SOD、CAT、GPx活性降低,MDA含量、炎症因子及NO含量、iNOS活性升高,可以作为建立BMEC氧化损伤模型的适宜条件。试验3以试验2为基础,以NO诱导BMEC的氧化损伤,采用完全随机试验设计,研究不同剂量的Se(0、10、20、50、100、150及200 nmol/L)对BMEC氧化损伤的保护和可能的调节作用机制,并筛选出Se的适宜添加剂量。结果表明,NO过量诱导BMEC发生了氧化应激,引起RGR与SOD、T-AOC、CAT活性显著下降,GPx、TrxR的活性及其基因与蛋白表达、Nrf2的基因表达呈现相似的变化;而ROS活性、MDA含量呈现相反的变化趋势;p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的基因表达也显著升高,并增加了其下游IL-1等炎症因子、iNOS的表达。Se的添加显著逆转了上述指标的变化,说明Se对NO诱发的氧化应激具有显著的减缓效果,减少了 IL-1的生成,降低了 iNOS的活性与NO的释放。这可能与增高的TrxR活性及其基因与蛋白表达,进而抑制了 MAPK信号通路的激活有关。Se对过量NO诱导的细胞损伤的保护作用呈剂量依赖性,其中以20～100 nmol/L的Se保护组保护作用较好,尤其以50 nmol/L的Se保护组的保护效果更好,然而,过高浓度的Se则未能逆转NO诱导的细胞损伤,甚至会对细胞造成一定的损伤作用。试验4以试验3为基础,采用完全随机试验设计,以DNCB抑制TrxR活性并诱导BMEC氧化应激,以IL-Ra抑制IL-1生物活性,从TrxR/IL-1/NO途径探究Se缓解NO诱导BMEC氧化应激的机理。将BMEC随机分为8组,分别是:对照组(CON)、Se 处理组(Se)、DNCB 损伤组(DNCB)、IL-1Ra 处理组(IL-1Ra)、Se+DNCB预保护组(S+D)、Se+IL-1Ra 处理组(S+I)、DNCB+IL-1Ra 保护组(D+I)、Se+DNCB+IL-1Ra处理组(S-D+I)。结果表明,DNCB抑制了 TrxR的活性及其基因与蛋白质的表达,导致凋亡信号调节激酶-1(ASK-1)活性升高,激活了 p38MAPK及JNK信号通路,增加了下游因子IL-1及NO浓度,诱导BMEC发生了氧化应激。IL-1Ra抑制了 IL-1的生物活性,降低了 NO过量生成,减缓了 DNCB引起的氧化应激,说明IL-1是诱发NO大量产生引起细胞氧化应激的关键因子。Se对DNCB引起的BMEC氧化损伤具有缓解作用,Se的添加促进了 TrxR的活性及其基因与蛋白质的表达;可逆转DNCB引起的p38MAPK及JNK信号通路的激活,进而抑制IL-1的生成、iNOS活性及NO的过量产生。这说明Se通过TrxR抑制IL-1的活性发挥其对BMEC氧化应激的减缓作用。试验5采用完全随机试验设计,以DNCB抑制TrxR活性并诱导BMEC氧化应激,以 SB203580、SP600125、PD98059 分别抑制 p38MAPK、JNK、ERK1/2 信号通路,将第三代贴壁生长的BMEC随机分为7个处理组,分别是:对照组、DNCB损伤组、Se 处理组、DNCB+Se 预保护组、DNCB+SB203580、DNCB+SP600125、DNCB+PD98059,从TrxR/MAPK/NO途径探究Se缓解NO诱导BMEC氧化应激的机理。结果表明,DNCB抑制了 TrxR活性,ASK-1活性增加,下游p38MAPK及JNK通路被激活,并导致IL-1过量释放,诱发BMEC氧化应激,Se的预保护作用逆转了 BMEC内的氧化损伤,增强了 TrxR的表达,ASK-1活性及p38MAPK及JNK通路磷酸化水平受到抑制,逆转了 IL-1的过量释放及其下游iNOS-NO级联。当p38MAPK及JNK通路分别受到SB203580、SP600125抑制后,DNCB诱导的细胞氧化损伤被抑制,MAPK信号通路下游因子IL-1含量、iNOS活性及其基因和蛋白表达受到显著抑制,进而保护细胞免受NO蓄积的损伤,这提示Se通过TrxR抑制p38MAPK及JNK通路的激活缓解BMEC的氧化损伤。试验6采用完全随机试验设计,以NO诱导BMEC氧化损伤,采用基因过表达技术对TrxR1进行过表达,将BMEC随机分为4个组,分别是:对照组、NO损伤组、NO+Se预保护组、NO+TrxR1 OE组,进一步研究TrxR1对细胞中iNOS、IL-1β等炎症因子及p38MAPK及JNK信号通路相关因子的表达的影响,验证TrxR1基因是否是Se缓解BMEC氧化损伤的关键基因。结果表明,过表达TrxR1基因显著降低了 p38MAPK及JNK信号通路的基因表达及磷酸化水平,及其下游IL-1β和iNOS的基因与蛋白表达,减缓了 NO诱导的氧化损伤,进一步验证了 TrxR1是Se缓解BMEC氧化应激损伤的关键基因。综上所述,本研究从TrxR1/MAPK/NO途径探讨了 Se促进BMEC抗氧化功能、缓解NO诱导BMEC氧化应激的保护机制,即Se通过促进TrxR1的基因和蛋白表达,抑制了 p38MAPK/JNK信号通路的磷酸化水平,进而降低了 IL-1β和iNOS的基因与蛋白质表达,抑制了 NO的过量释放,保护了 BMEC免受氧化应激的损伤。