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目的: 采用基因克隆表达技术，使用pFN19A(HaloTag(R)) T7 SP6 Flexi载体，分别构建WISP-1四个结构域蛋白的pFN19A(HaloTag7)T7 SP6 Flexi载体，分别标记为pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK，含有Halo标签的蛋白位于WISP-1四个结构域蛋白的氨基末端;通过一步法(KRX)感受态细胞用于对构建好的载体进行有效转化;将诱导表达的带有HaloTag的WISP-1四个结构域蛋白用HaloLink树脂进行高效并特异性的共价固定，使用TEV蛋白酶从HaloLink树脂上将WISP-1各结构域蛋白切下，从而使HaloLink树脂与目的蛋白分离开，这样就获得了纯度较高的WISP-1各结构域的蛋白，通过克隆形成实验，在细胞层面找到可能介导食管癌细胞发生放疗抵抗的关键结构域，采用噬菌体文库筛选技术，筛选出能够与特定结构域蛋白特异结合的噬菌体，为后续研究靶向针对WISP-1蛋白的药物多肽奠定基础。 方法: 1.构建并鉴定表达质粒(pFN19A Halo-IGFBP, Halo-VWFC, Halo-TSP, Halo-CTCK): 采用基因克隆表达技术，采用蛋白质编码序列定向克隆的方法，应用VectorNTI10.0生物学软件对编码WISP-1四个结构域蛋白的cDNA碱基序列进行密码子优化，含有Halo标签的原始质粒购自美国Promega公司，通过酶切、连接反应，将其克隆到表达质粒pFN19A(HaloTag(R)) T7 SP6 Flexi中，构建出新的原核表达质粒pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK，并通过菌落PCR，、酶切鉴定、DNA测序，鉴定构建的质粒。 2.WISP-1四个结构域融合蛋白的诱导与纯化: 将构建好的原核表达质粒pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK转化至感受态表达菌KRX中，挑取经过验证的单克隆菌加入含有Amp的LB中扩增，当菌体A值达到0.4-0.5时加入鼠李糖至终浓度为0.05％，根据优化后的条件25-37℃诱导过夜，第二天离心沉淀菌体，用蛋白纯化液重悬菌体，超声破菌，按照Halo蛋白纯化系统的策略进行目的蛋白的纯化，得到WISP-1四个结构域蛋白后采用考马斯亮蓝及WB对蛋白进行鉴定。 3.各结构域蛋白对食管鳞癌细胞株KYSE-150放疗抵抗的初步研究 将纯化后得到的四个结构域的蛋白分别加入食管鳞癌细胞株KYSE-150中，对细胞进行放疗并设置剂量梯度，通过克隆形成实验找到对KYSE-150细胞株发生放疗抵抗的关键结构域蛋白. 4.筛选出能够与关键结构域特异性结合的噬菌体 确定了关键结构域蛋白后，通过噬菌体筛选技术，得到可能能够与关键结构域蛋白相结合的噬菌体，采用ELISA法检测阳性的噬菌体克隆，最终得到能够与关键结构域蛋白特异结合的单克隆噬菌体。 结果: 1.WISP-1四个结构域融合蛋白表达质粒的构建及鉴定: 菌落PCR、酶切分析、DNA测序等实验的鉴定结果与预期相符，成功构建了WISP-1四个结构域融合蛋白的原核表达质粒，分别标记为:pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC, Halo-TSP, Halo-CTCK; 2.WISP-1四个结构域融合蛋白的诱导与纯化: WB和考马斯亮蓝染色显示在45kD分子量大小有一特异性的目的条带，与融合蛋白Halo-IGFBP/VWFC/TSP/CTCK理论分子量相符，说明融合蛋白成功在大肠杆菌KRX中表达;按照Halo蛋白纯化系统的策略进行目的蛋白的纯化，得到WISP-1四个结构域蛋白后采用考马斯亮蓝及WB对蛋白进行鉴定。 3.四个结构域蛋白与食管鳞癌细胞株KYSE-150放疗后的克隆形成实验 将纯化后得到的四个结构域的蛋白(IGFBP/VWFC/TSP/CTCK)分别加入食管鳞癌细胞株KYSE-150中，对细胞进行放疗并设置剂量梯度，分别为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy，通过克隆形成实验找到WISP-1蛋白介导KYSE-150细胞株发生放疗抵抗的关键结构域蛋白为WFC. 4.与VWFC结构域特异性结合的噬菌体 确定了关键结构域蛋白(VWFC)后，通过噬菌体文库筛选技术，得到可能能够与VWFC结构域蛋白相结合的噬菌体，采用ELISA法检测阳性的噬菌体克隆，最终得到了5个能够与VWFC结构域蛋白特异结合的噬菌体单克隆。 结论: 成功构建了WISP-1四个结构域融合蛋白的原核表达质粒(pFN19AHalo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK)，将构建好的质粒转化至大肠杆菌KRX中，采用HaloTag蛋白纯化系统对目的蛋白进行纯化，经过考马斯亮蓝及WB对蛋白进行鉴定，成功获得了产量大、纯度较高并具有功能的WISP-1各结构域的可溶性蛋白，通过克隆形成实验找到介导放疗抵抗的关键结构域蛋白，采用噬菌体肽库筛选技术，筛选出能够与关键的结构域蛋白特异性结合的噬菌体，为后续研究靶向针对WISP-1蛋白的药物多肽奠定基础。