Toll样受体是一种高度保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白模式识别受体,可以识别多种微生物的病原相关分子模式,快速启动免疫应答,在机体的抗感染过程中发挥重要的作用。2006年,Higgs等对鸡的基因组进行生物信息学分析,发现了一个定位于鸡的第三条染色体上特有的基因,将之命名为鸡Toll样受体15（Chicken toll like receptor 15,ChTLR15）。迄今,除邢波建等制备出ChTLR15多克隆抗体外,未见关于ChTLR15单克隆抗体的报道,研制并获得ChTLR15的单克隆抗体（Monoclonal antibody,MAb）对研究其生物学特性与功能,具有重要意义。本研究根据GenBank中发表的ChTLR15基因序列设计引物,利用PCR技术扩增出部分胞外区序列,即编码第162-386位氨基酸（Amino acid,aa）的序列,长度为675 bp,将其克隆至原核表达质粒pET-30a中,构建了重组质粒pET-30a-ChTLR15（162-386aa）,将该重组质粒导入宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导发现ChTLR15（162-386aa）-His主要以包涵体形式表达,蛋白大小约为26kDa,随后采用尿素梯度透析法对其进行复性。通过Ni-NTA亲和层析介质和凝胶过滤层析纯化,获得了高纯度的重组ChTLR15（162-386 aa）-His蛋白,以皮下多点注射方式将其免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠,并通过间接酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）确定抗原最适包被浓度为0.35 μg/mL,血清最适稀释度为1:6400。三次免疫后用确立的间接ELISA检测条件测定小鼠效价,效价符合要求后即可取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。采用杂交瘤细胞技术和有限稀释法,经过3次亚克隆获得4株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2G4、6C7、6D10、7C4。通过Western blot对4株单抗特异性进行鉴定,结果显示4株单抗均能与免疫原蛋白反应。采用间接ELISA及间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IFA）两种方法同时筛选,ELISA结果显示6C7、6D10反应性较强,2G4、7C4反应性微弱。IFA实验结果显示,2G4、6C7、7C4在可传代的鸡巨噬细胞系HD11及鸡成纤维细胞系DF-1上具有不同强度的荧光反应,却不具备瞬转人源胚胎肾细胞HEK293T（Human emborynic kidney 293T cell,HEK293T）荧光反应性;6D10具备瞬转HEK293T反应性而不具备HD11及DF-1荧光反应性。制备腹水并检测四株单抗的ELISA和IFA效价,结果表明6C7和6D10的腹水ELISA效价分别为1:20480、1:40960,2G4和7C4腹水无ELISA效价;6C7和7C4在传代细胞系HD11及DF-1中腹水IFA效价分别为1:2560、1:5120,而2G4较低,6D10在传代细胞系中无IFA效价;6D10瞬转HEK293T细胞IFA效价为1:320。根据单克隆抗体亚类分型试剂盒对所获得的4株单抗细胞上清进行亚类鉴定,结果显示2G4与6C7亚类为IgG2a、6D10与7C4亚类为IgG1。为确定单克隆抗体所针对的抗原表位,我们采用逐步截短免疫原与单抗进行反应的策略。经过Western blot鉴定,确定单抗2G4与7C4识别的抗原表位为230QLGTVLEF237、6C7与6D10识别的抗原表位为245EMDLLS250。筛选精准的抗原表位可深化对免疫反应的认知,有助于更加准确的使用单抗。利用6C7株单抗对禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）感染鸡的脏器进行免疫组化检测,结果显示感染鸡肝、脾、肺、肾的TLR15表达量增加,而对照组仅有少量TLR15表达。利用6C7株单抗采用激光共聚焦技术观察ChTLR15在HD11细胞中的定位,结果显示ChTLR15蛋白位于细胞表面。本研究制备的单抗具有较好的特异性和反应性,为ChTLR15有关的免疫调节机制研究提供了重要的物质保障,也可为后续抗感染机理的研究奠定基础。