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目的:探索苯海索(trihexyphenidyl,THP)对氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)后体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB)上P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)变化的影响及机制研究。方法:(1)原代培养大鼠脑微血管内皮细胞(rat brain microvascular endothelial cells,r BMECs)和星形胶质细胞,免疫荧光染色法鉴别r BMECs;采用MTT法检测不同时间OGD对r BMECs的细胞存活率影响,通过Transwell建立共培养体系模拟体外BBB,每天监测共培养体系跨膜电阻值(transendothelial electrical resistance,TEER),待其达到稳定后进行后续实验;通过测定由内室到外室荧光素钠(fluorescein sodium,Na F)转运的表观渗透系数(apparent permeability coefficient,Papp)研究不同时间OGD损伤r BMECs后对BBB紧密连接的影响;再分别测定共培养体系罗丹明123(Rhodamine123,Rh123)转运的Papp值研究不同时间OGD损伤r BMECs后对P-gp功能的影响;采用蛋白印迹法(Western Blot)测定不同时间OGD损伤r BMECs后对P-gp表达的影响;综合以上筛选确定OGD损伤时间;在此损伤时间上,采用免疫荧光染色法检测OGD损伤后对星形胶质细胞的激活。(2)MTT法检测THP对r BMECs的细胞毒性以及THP对OGD损伤r BMECs后细胞存活率的影响,并在显微镜下观察其细胞形态学变化;借助Transwell体系研究THP对OGD损伤r BMECs后体外BBB紧密连接以及P-gp功能的影响;采用Western Blot法测定THP对OGD损伤r BMECs后P-gp表达的影响;并检测THP对OGD损伤后r BMECs内的氧化应激相关指标的变化,如:活性氧族(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH);(3)使用免疫荧光法检测THP对r BMECs损伤后Occludin、NF-κB和P-gp的影响;Western Blot法检测r BMECs损伤后紧密连接相关蛋白MMP-9、i NOS、Occludin和ZO-1以及P-gp相关蛋白Akt、ERK1/2、NF-κB及其磷酸化状态分子的表达水平,同时加入相应的抑制剂进一步研究其相互作用关系。结果:(1)借助Transwell建立原代培养的r BMECs和星形胶质细胞共培养体系,可成功构建体外BBB模型;OGD 4 h可导致r BMECs损伤,BBB结构破坏,P-gp功能亢进,同时激活星形胶质细胞。(2)THP(0.1μM,1μM,10μM)预处理2 h能够改善OGD诱导的r BMECs细胞损伤,修复细胞间的紧密连接;并降低P-gp的表达水平,逆转P-gp功能亢进;THP预处理2 h可降低OGD诱导的r BMECs内ROS含量,并提高SOD、GSH和CAT的酶活性,具有明显的抗氧化作用。(3)THP可降低r BMECs损伤后紧密连接相关蛋白MMP-9和i NOS的蛋白表达,上调Occludin和ZO-1蛋白表达;通过抑制Akt、ERK1/2、NF-κB及其磷酸化状态分子的表达,降低r BMECs内P-gp的表达水平。结论:THP通过降低OGD损伤后r BMECs内ROS含量,提高抗氧化物酶活性发挥抗氧化作用,进而调节体外血脑屏障上P-gp变化,其机制可能与PI3K/Akt及ERK1/2信号通路有关。