论文部分内容阅读
目的:我国是食管癌发病率最高的国家之一,每年大约有30万新发病例,食管癌具有高复发转移的特点,同年龄段、同性别、肿瘤大小相似、病理所见相似、临床分期相同的患者其生存率长短不一,复发、转移的机会大相径庭,提示食管癌可能存在病理不可分的亚型,cDNA microarray (cDNA生物芯片)技术是把数千到数万个基因的核苷酸链用纳米技术分别打到芯片上,芯片和带有荧光的cDNA探针杂交,根据扫描荧光强度测得各个基因的表达量,生物芯片技术已经用于食管癌分型,利用它已经鉴别出了区分Barrett食管和食管癌的基因群,也鉴别出了在食管癌及相对应的正常组织不同表达的基因群,日本学者也证实了食管鳞状细胞癌不同的基因型可以预测转移率。而对于我国的食管癌尚未有系统的可以预测术后生存率及转移情况的芯片基因分型的报道,多核糖体芯片比普通cDNA芯片更接近于蛋白表达量变化,本课题运用多核糖体基因芯片技术,对食管鳞状细胞癌标本进行多核糖体cDNA基因分析和分型,并力争找出在肿瘤发生和发展中起决定意义的基因或基因组,指导术后治疗,提高患者生存率。方法:1研究对象:选取2009年1月至2009年3月河北医科大学第四医院胸外科经手术切除及病理学检查证实的食管鳞状细胞癌标本16例,其中Ⅱ期9例,Ⅲ期7例,患者术前未经过放疗和化疗,标本病理类型由资深主任医师确认后迅速冷冻在液氮中,置于-80℃的冰箱中保存。多核糖体基因芯片由美国Agilent公司提供,每张芯片有44000个点,含34000个已知基因。2多聚核糖体RNA提取:取冰冻的食管癌组织200mg在研钵中碾成粉末,将粉末溶解在1ml裂解缓冲液中,同时加入1%脱氧胆酸溶解蛋白。裂解溶液用移液器吹打后在4℃以12000g离心10秒钟将细胞核去除,将离心后的上清液加入500ul提取缓冲液,在4℃以12000g离心5分钟将线粒体、核膜碎片和其他细胞器去除,将离心后的上清液放入蔗糖密度梯度(15%-40%),在SW41Ti rotor中于4℃以38000g离心120分钟,由上到下逐次提取1ml上清液,共收集12管,各管分别加入100ug蛋白酶K于37℃处理30分钟,用酚氯仿酒精将RNAs萃取重吸收,用酒精沉淀RNA并收集。3探针标记及microarray试验:用逆转录酶(invitrogen公司)转录RNA,以Cy3-DUTP(Agilent公司)标记肿瘤RNA,Cy5-DUTP标记人正常参照RNA(Human reference RNA),将标记好的探针和44k多核糖体基因芯片(Agilent公司)杂交,用GenePix 4000A scanner(invitrogen公司)扫描芯片图像,并用GenePix Pro4.0软件分析结果,使用非监督分层聚类分析方法自动将食管鳞状细胞癌基因分型;用微阵列显著性分析方法鉴定出两型间显著变化的基因。结果:1紫外分析及电泳检测显示成功提取了高质量的polysomeRNA;并获得食管鳞状细胞癌多核糖体生物芯片表达图谱,图像位点及密度均匀,图像清晰;2使用非监督分层聚类分析方法对16例食管鳞状细胞癌多核糖体基因表达谱进行分析,将每例标本表达的基因作为一类,计算16例标本表达基因两两之间的距离,构成距离矩阵,合并距离最近的两类为一新类,根据基因表达相似性分为A、B两亚型,A亚型有4例,B亚型有12例。3以微阵列显著性分析方法在P=0.01水平鉴定出A亚型和B亚型间显著变化的基因,共找出832个差异表达基因,这832个基因涉及细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号传导通路等方面, Jun、XAF1、TNFSF4、RASSF5等基因是两个亚型之间的差异基因,和食管鳞状细胞癌的基因分型相关联。结论:1本实验成功提取食管鳞状细胞癌polysomeRNA,并获得多核糖体基因表达图谱。2食管癌存在区别于病理分型的基因亚型,亚型之间差异表达的基因群可能和肿瘤发生、发展有关。