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目的探析左归丸“益精填髓”壮(软骨下骨、软骨)骨防治骨关节炎的基础,建立绝经后骨质疏松与绝经后骨关节炎共病模型,揭示其防治绝经后骨关节炎的效应与机制,为中医药防治绝经后骨关节炎提供新思路。方法1.理论研究:系统整理与总结中医“肾藏精,主骨生髓”等理论以及现代软骨下骨/软骨研究的成果,分析软骨下骨重建及其与软骨的信号交互和肾生髓充骨在绝经后骨关节炎中的机理,从软骨—软骨下骨信号交互的角度探究左归丸益精填髓防治绝经后骨关节炎的机制。2.实验研究:(1)以去卵巢法建立绝经后骨质疏松与绝经后骨关节炎共病模型。研究分为左归丸药物组(分低、高剂量组)、模型组、阳性对照组(阿伦磷酸钠)、阴性对照组(假手术组)。药物干预3月后,取左侧股骨行HE、番红—固绿染色观察软骨下骨与软骨组织病理形态,并使用Micro-CT对软骨—软骨下骨进行骨微结构观察与测量。(2)用Corrplot包和主成分分析对骨关节炎基因数据集GSE82107进行质量评估。使用GEO2R分析并筛选差异表达基因,对差异表达基因的功能富集分析初步筛选与OA相关的神经肽受体。再经WGCNA计算获得基因共表达网络,并与神经肽受体建立蛋白互作网络分析核心集簇。用比较毒理基因组数据库及受试者工作特征曲线分析神经肽受体与OA疾病的关系并评估、识别其在骨关节炎病变中的效力。(3)Western blot检测右侧胫骨软骨下骨组织NPY、NPY1R、NPY2R蛋白以及RANKL、OPG、RUNX2蛋白表达情况。(4)Western blot检测右侧胫骨软骨组织NPY、NPY1R、NPY2R蛋白表达情况。结果1.理论研究:肾虚精亏髓枯是绝经后骨关节炎的基本病机,补肾益精填髓是防治绝经后骨关节炎的基本大法,左归丸是干预软骨—软骨下骨信号交互防治绝经后骨关节炎的方剂。2.实验研究(1)HE染色示模型组大鼠股骨骨小梁排列稀疏,紊乱且不连续,结构缺如;关节软骨层次紊乱,厚度减少,潮线模糊甚至消失。阳性对照组、左归丸低剂量组、左归丸高剂量组大鼠股骨骨小梁病理改变均有不同程度改善;软骨细胞排列较整齐,潮线较为完整。番红—固绿染色示模型组大鼠股骨关节软骨表面粗糙,有剥脱,软骨基质染色减少。阳性对照组、左归丸低剂量组、左归丸高剂量组大鼠股骨关节软骨结构较为完整,细胞排列较为有序,软骨基质染色良好。Micro-CT示模型组大鼠股骨骨小梁数明显减少,分布稀疏,结构缺失,纹理变细,且软骨厚度变薄。阳性对照组、左归丸低剂量组、左归丸高剂量组大鼠股骨骨小梁数量均有不同程度增多,骨密度与软骨厚度增加。(2)基因表达矩阵GSE82107具有较高的数据质量。本研究从中鉴定出1676个差异基因,包括218个上调差异基因和1458个下调差异基因。功能富集分析发现,包括“激素调节”、“骨重建”、“骨生长”、“软骨发育”等与骨关节炎相关的生物学过程具有统计学意义。经筛选,发现NPY1R与NPY2R均涉及肌肉骨骼等生理病理过程。而MEgreen模块与骨关节炎有较高的相关性,且NPY]R、NPY2R与MEgreen基因模块亦具有更为紧密的互作关系。此外,NPY1R、NPY2R均与骨质疏松症,骨骼疾病,绝经后骨质疏松症,关节疼痛、软骨病以及骨吸收等疾病或病理过程关系密切。受试者工作特征曲线分析结果表明,NPY1R与NPY2R在骨关节炎病变中发挥重要的生物学意义,且具有可靠性。(3)Western blot结果发现,模型组大鼠软骨下骨组织中RUNX2、OPG蛋白表达量降低(P<0.05),同时RANKL蛋白表达量升高(P<0.05)。而阳性对照组和左归丸高剂量组的RUNX2、OPG蛋白表达量升高(P<0.05),RANKL蛋白表达量降低(P<0.05);但左归丸低剂量组上述蛋白表达无统计学差异。此外,模型组大鼠软骨下骨组织中NPY、NPY1R、NPY2R蛋白表达量降低(P<0.05)。阳性对照组和左归丸高剂量组上述蛋白表达量升高(P<0.05);左归丸低剂量组上述蛋白表达无统计学差异。(4)模型组大鼠软骨组织中NPY、NPY1R、NPY2R蛋白表达量降低(P<0.05)。阳性对照组和左归丸高剂量组上述蛋白表达量升高(P<0.05);左归丸低剂量组NPY、NPY2R蛋白表达量升高(P>0.05),NPY1R蛋白表达量升高(P<0.05)。结论1.“补肾—益精填髓—壮骨”的左归丸是干预软骨—软骨下骨防治绝经后骨关节炎的有效方剂。左归丸可改善去卵巢绝经后骨质疏松与绝经后骨关节炎共病模型大鼠软骨下骨、软骨病变,提高骨密度,增加软骨厚度,具有修复软骨下骨及软骨的作用。2.神经肽受体NPY1R、NPY2R与骨关节炎病理密切相关,且NPY1R、NPY2R对评估及识别骨关节炎病变具有较强的效力。3.NPY及其受体NPY1R与NPY2R参与了绝经后骨关节炎的病变。左归丸可提高软骨下骨中三者的蛋白表达,并通过对RANKL/OPG通路的调控,促进软骨下骨形成(增加RUNX2蛋白表达),抑制骨吸收,有助于恢复骨重建平衡,防治绝经后骨关节炎软骨下骨质疏松。4.左归丸可促进软骨组织NPY及其受体NPY1R与NPY2R蛋白表达,阻止软骨退化,促进软骨修复,防治绝经后骨关节炎软骨病变。