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背景:南极磷虾作为地球上生物量最大的物种体内富含虾青素和多不饱和脂肪酸。虾青素的抗氧化活性极高,具有多种生物活性,在提高免疫力、抗菌消炎等方面均有一定成效,具有极高的研究价值。虾青素在自然界中主要以三种形式存在,游离的虾青素、虾青素一酯、虾青素二酯,其中主要形式是虾青素一酯和虾青素二酯,虾青素一酯是虾青素一边结合脂肪酸形成的酯类,虾青素二酯是虾青素两边结合脂肪酸形成的酯类。虾青素一酯和虾青素二酯没有标准品,国内对虾青素酯的研究还不是很成熟,尤其是南极磷虾中的虾青素酯,亟待进行研究开发。 目的:本文旨在建立快速高效提取纯化南极磷虾中虾青素一酯和虾青素二酯的方法,并对南极磷虾中的虾青素一酯、虾青素二酯进行脂肪酸结构分析和抗氧化活性的初步分析。 方法:以南极磷虾中虾青素酯为研究对象,利用单因素实验分别确定了虾青素一酯和虾青素二酯的最佳提取条件,利用柱层析分离技术对其中的虾青素一酯及虾青素二酯分别进行了纯化,将纯化后的虾青素一酯和虾青素二酯进行了甲酯化,后将上清液进行气相色谱与质谱联用,分析其脂肪酸结构,利用DPPH·法对VE、虾青素、虾青素一酯及虾青素二酯的体外抗氧化活性进行了初步的比较和分析。 结果 1利用高效薄层层析扫描技术对南极磷虾虾油进行了虾青素类物质的检测及分析,在486nm下,分别在rf值0.25、0.39、0.76处测得虾青素(12％)、虾青素一酯(24%)、虾青素二酯(64%)。 2针对虾青素一酯采用不同溶剂、时间、温度、提取次数、料液比对虾油进行单因素提取实验,探索不同提取条件的提取效果,得到最适合南极磷虾虾青素一酯的提取条件:25℃下,1:20(m/v)的料液比用丙酮进行提取,提取1h,反复提取3次;对柱层析分离纯化虾青素一酯的条件进行了探索和优化,最终采用①石油醚:乙酸乙酯10:1,②石油醚:乙酸乙酯7:1,③石油醚:乙酸乙酯4:1的流动相对粗样进行柱层析分离纯化,分离纯化的虾青素一酯采用高效薄层扫描仪检测纯度达到99.8%以上;将得到的一酯进行甲酯化,冷却后取上清进行气相色谱与质谱联用,检测出12种脂肪酸(C12:02.39% C14:00.65% C16:04.00%C16:12.68% C16:20.57% C18:00.95% C18:12.94% C18:21.44% C18:31.09%C20:546.13%C20:5trans:9.40%C22:627.76%),其中主要脂肪酸为EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)分别占55.53%和27.76%,此外其脂肪酸构成多为多不饱和脂肪酸,占总脂肪酸的85.82%。 3对虾青素二酯采用不同溶剂、时间、温度、提取次数、料液比对虾油进行单因素提取实验,并探索不同提取条件的提取效果,得到最适合虾青素二酯的提取条件:4℃下,1:10(m/v)的料液比用乙醇进行提取,提取1h,反复提取3次;对柱层析分离纯化虾青素二酯的条件进行了探索和优化,最终采用①纯石油醚,②石油醚:乙酸乙酯20:1,③石油醚:乙酸乙酯10:1的流动相对粗样进行柱层析,分离纯化后的虾青素二酯经高效薄层扫描仪检测,纯度达到99.9%以上;将得到的二酯进行甲酯化,冷却后取上清进行气相色谱与质谱联用,检测出15种脂肪酸(C14:04.23% C16:06.14% C16:1(9-Z)5.07% C16:1(7-Z)0.31%C16:1(11)0.54% C16:2(9,12)1.12% C18:00.34% C18:1(9-E)7.15% C18:1(11-E)6.11% C18:2(8,11)2.79% C18:3(all-Z,9,12,15)1.40% C20:1(11)1.38%C20:5(all-Z,5,8,11,14,17)38.46%C20:5(5,8,11,14,17)4.51% C22:620.45%),其中主要脂肪酸为 EPA和 DHA,分别占42.97%和20.45%,多不饱和脂肪酸占67.71%。 4利用DPPH法对南极磷虾中的虾青素一酯、虾青素二酯、虾青素和VE的体外抗氧化活性进行了初步的对比和分析,实验结果显示虾青素一酯和二酯的DPPH自由基清除率均比虾青素高,虾青素二酯的清除率在四者中最强,虾青素一酯的清除率次之,但三者的清除率均比VE强。这种结果很有可能与南极磷虾中虾青素大量结合不饱和脂肪酸有关。 结论与创新 建立了新的南极磷虾虾青素一酯、虾青素二酯的柱层析纯化体系,得到了纯净的虾青素一酯和虾青素二酯。 分析了南极磷虾中虾青素一酯、虾青素二酯的脂肪酸构成,确定南极磷虾中虾青素一酯和虾青素二酯富含多不饱和脂肪酸。