研究背景:多柔比星（Doxorubicin,DOX）是常见的蒽环类抗肿瘤药物,通过化疗可诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖及血管生成,在治疗时常显示出剂量依赖性心脏毒性,由于心脏是一个高能量依赖性器官,心肌细胞属于终末分化细胞,出生后无法继续分裂增殖,当心脏长期受到蒽环类药物影响时则会出现心肌细胞损伤,最后发展为累积的心肌损伤和内源性心脏修复能力的失衡,从而最终导致心力衰竭。多柔比星诱导心肌细胞损伤时发生了心肌细胞死亡,直接导致心肌细胞数量减少,造成心脏结构和功能的破坏。铁死亡作为一种新的细胞死亡形式,是心力衰竭心肌细胞损伤的重要表现形式,可进一步加重心肌细胞损伤程度,其中,线粒体的氧化损伤是铁死亡诱导心肌细胞损伤的重要机制,多柔比星诱导心肌细胞发生铁死亡主要是由于线粒体氧化应激损伤导致ROS产生及铁负荷形成的脂质过氧化,因此减轻多柔比星诱导的心肌细胞铁死亡在临床中具有重要意义。核因子 E2 相关因子 2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）在铁死亡中起到重要的作用,Nrf2信号的激活可一定程度逆转铁死亡进程,反之则会加重铁死亡,因此激活Nrf2信号通路抑制铁死亡成为减轻心肌细胞损伤的新兴方法而受到广泛关注,成为心肌细胞损伤治疗的重要切入点。芪苈强心胶囊具有“多成分、多靶点、多通路”的治疗特点,常用于慢性心力衰竭的治疗,可显著改善心肌细胞损伤,本研究进一步探讨了芪苈强心胶囊对多柔比星诱导的心肌细胞损伤模型中Nrf2-铁死亡途径的干预作用。因此,本研究以H9c2心肌细胞为研究对象,利用多柔比星干预H9c2心肌细胞,探讨H9c2心肌细胞损伤模型的生物学特性,为心肌细胞损伤的体外研究提供模型构建,同时进一步探讨了芪苈强心胶囊减轻心肌细胞损伤的机制,为临床应用提供了体外研究的理论基础。目的:1.分析多柔比星不同作用浓度及不同作用时间的优势与限制,观察H9c2心肌细胞经多柔比星干预后细胞增殖能力、细胞形态以及细胞ROS水平的改变,为体外H9c2心肌细胞损伤模型的选择提供参考数据与理论基础。2.观察心肌细胞损伤模型中铁死亡的改变,探讨芪苈强心胶囊对铁死亡的干预作用。3.观察Nrf2通路的激动剂和抑制剂对心肌细胞损伤模型的影响,探讨芪苈强心胶囊是否通过激活Nrf2通路从而抑制心肌细胞铁死亡。方法:1.体外培养H9c2心肌细胞株,传代2-5次,待细胞状态趋于稳定,采用CCK-8细胞增殖实验方法,检测多柔比星的5种作用浓度在6h、12h及24h作用时间下,对H9c2心肌细胞增殖情况的影响;同时结合光学倒置显微镜观察H9c2心肌细胞经多柔比星诱导后细胞形态学的改变;再通过细胞ROS检测试剂盒,观察多柔比星对H9c2心肌细胞ROS水平的影响,筛选得出最佳的多柔比星干预浓度用于后续实验。2.称取芪苈强心胶囊溶于完全培养基,过滤,配制浓度分别为25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L、750mg/L、1000mg/L、1250mg/L、1500mg/L 的芪苈强心胶囊溶液;称取卡维地洛粉末溶于完全培养基,配制浓度分别为1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L 的卡维地洛溶液;通过 CCK-8检测试剂盒,筛选出对细胞无明显毒性的芪苈强心胶囊及卡维地洛药物浓度,测定芪苈强心胶囊及卡维地洛对造模后细胞的有效浓度且确定芪苈强心胶囊低中高剂量组,并测定各组细胞处理后的细胞增殖情况;通过光学倒置显微镜观察各组细胞形态学变化;通过电镜观察对照组、模型组、芪苈强心各剂量组及卡维地洛组细胞线粒体超微结构的改变;通过普鲁士蓝染色观察各组细胞铁沉积面积的不同;通过GSH试剂盒测定各组细胞GSH含量的不同;通过MDA检测试剂盒测定各组细胞MDA含量的不同;通过SOD检测试剂盒测定各组细胞SOD活性的高低;通过ROS含量检测试剂盒观察各组细胞ROS水平的差异;通过Western-blot实验,研究不同浓度的芪苈强心胶囊对多柔比星诱导的H9c2心肌细胞损伤模型中Nrf2及铁死亡调节蛋白system xc-、GPX4的表达。3、称取Nrf2激动剂tBHQ粉末,配制浓度分别为1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L 的 TBHQ 溶液;称取 Nrf2 抑制剂 ML385 粉末,配制浓度分别为 1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L的ML385溶液;通过CCK-8检测试剂盒筛选出对细胞无明显毒性的激动剂及抑制剂浓度,测定激动剂及抑制剂对造模后细胞的有效浓度,将实验分为空白组（C）、空白+激动剂组（C+J）、空白+抑制剂组（C+Y）、模型组（M）、模型+芪苈强心组（M+QLQX）、模型+激动剂组（M+J）、模型+激动剂+芪苈强心组（M+J+QLQX）、模型+抑制剂组（M+Y）、模型+抑制剂+芪苈强心组（M+Y+QLQX）,测定各组细胞处理后的细胞增殖情况;通过光学倒置显微镜观察各组细胞形态学变化;通过电镜观察各组处理后的细胞线粒体超微结构的改变;通过普鲁士蓝染色观察各组细胞铁沉积面积的不同;通过GSH试剂盒测定各组细胞GSH含量的不同;通过MDA检测试剂盒测定各组细胞MDA水平的不同;通过SOD检测试剂盒测定各组细胞SOD水平的高低;通过ROS含量检测试剂盒观察各组细胞ROS水平的差异;通过Western-blot实验,研究芪苈强心胶囊通过激活Nrf2通路抑制多柔比星诱导的H9c2心肌细胞损伤模型中铁死亡的相关蛋白system xc-、GPX4及Nrf2蛋白的表达。结果:1.通过CCK-8细胞增殖实验、倒置显微镜观察细胞生长状态及细胞ROS水平的测定结果确定以0.5μmol/L多柔比星干预12h作为H9c2心肌细胞损伤模型最佳造模条件用于后续实验。2.多柔比星可诱导心肌细胞铁死亡,与空白组相比,多柔比星可显著抑制H9c2心肌细胞增殖,损伤线粒体结构及功能,增加细胞普鲁士蓝铁染色面积,升高心肌细胞ROS、MDA水平,降低心肌细胞SOD活性及GSH含量,降低system xc-、GPX4及Nrf2的蛋白表达,导致H9c2心肌细胞氧化损伤及铁死亡的发生。与模型组相比,芪苈强心胶囊可促进H9c2心肌细胞增殖,改善心肌细胞形态,保护线粒体形态及功能,减少普鲁士蓝铁染色的比例,降低心肌细胞ROS、MDA含量,增强心肌细胞SOD活性及GSH含量;与卡维地洛组相比,芪苈强心胶囊可显著增强心肌细胞SOD活性及GSH含量,证明芪苈强心胶囊能有效降低多柔比星对H9c2心肌细胞的氧化损伤,保护心肌细胞的生理功能。芪苈强心胶囊可降低心肌细胞铁死亡,与模型组相比,芪苈强心胶囊可增加system xc-、GPX4及Nrf2的蛋白表达;与卡维地洛组相比,芪苈强心胶囊高剂量组可显著上调Nrf2蛋白的表达。证明芪苈强心胶囊降低心肌细胞氧化损伤,减轻铁死亡可能与system xc-、GPX4及Nrf2表达的上调有关,其中,关于铁死亡信号通路Nrf2的作用机制还需要进一步的探讨。3.与模型组（M）相比,模型+芪苈强心组（M+QLQX）、模型+激动剂组（M+J）、模型+激动剂+芪苈强心组（M+J+QLQX）均可增加H9c2心肌细胞增殖,保护线粒体功能,减少细胞铁沉积面积,降低H9c2心肌细胞ROS、MDA含量,增强心肌细胞SOD活性,模型+抑制剂组（M+Y）可抑制H9c2心肌细胞增殖,损伤线粒体功能,增加普鲁士蓝铁沉积面积,增加H9c2心肌细胞ROS、MDA含量,降低心肌细胞SOD活性及GSH含量;与模型+抑制剂组相比,模型+抑制剂+芪苈强心组H9c2心肌细胞增殖上升,线粒体结构及功能有明显好转,细胞铁沉积面积明显降低,心肌细胞ROS、MDA含量显著下降,细胞SOD活性及GSH含量显著上升,以上结果证明芪苈强心胶囊及Nrf2激动剂tBHQ可激活Nrf2信号通路,有效降低心肌细胞氧化损伤及铁死亡,促进心肌细胞功能的恢复,Nrf2抑制剂ML385可抑制Nrf2信号通路,增加心肌细胞氧化应激水平,进一步加强铁死亡程度。结论:1.H9c2心肌细胞损伤模型的建立是由浓度为0.5μmol/L多柔比星干预12h完成的,可用于铁死亡细胞实验的研究。2.多柔比星可导致H9c2心肌细胞氧化应激损伤,诱导铁死亡的发生;芪苈强心胶囊可减轻多柔比星诱导的H9c2心肌细胞氧化损伤,抑制铁死亡的发生。3.芪苈强心胶囊可能通过Nrf2信号通路上调system xc-、GPX4的表达从而减轻多柔比星诱导的H9c2心肌细胞铁死亡。