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目的与意义转录因子FOXK1作为FOX家族的一个成员,参与细胞的生长代谢,在多种肿瘤的发生发展中可能发挥重要作用。有研究表明,FOXK1的高表达与结直肠癌的发生发展密切相关,能促进结直肠癌细胞的增值侵袭与转移,影响结直肠癌患者预后。FHL2(Four and a half LIM Protein 2)作为癌基因,在胃肠道肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。有文献报道,FHL2蛋白能与多种靶蛋白结合并调控靶蛋白的活性,是诱导上皮间质转化(EMT)和侵袭的一个关键的蛋白,在胃肠道肿瘤中高表达,正常组织中不表达。目前有研究FOXK1与FHL2在肌源性祖细胞中的相互作用,但在胃肠道肿瘤中的相互作用机制研究甚少。本课题主要研究FOXK1与FHL2在结直肠癌中的相互作用,评估FOXK1与FHL2的表达对结直肠预后的影响,为结直肠癌探索新的治疗靶点提供依据。材料和方法主要材料SW480、Caco2、SW620细胞,FOXK1抗兔单克隆抗体、FHL2抗兔/鼠单克隆抗体,E-cadherin、GAPDH 抗兔单克隆抗体、Vimentin、MMP2、MMP9、Snail抗鼠单克隆抗体,抗鼠荧光二抗、抗兔荧光二抗,罗丹明标记鬼笔环肽,EdU试剂盒,结晶紫。主要方法1.收集结直肠癌组织,用qRT-PCR和免疫组化检测并比较FOXK1在结直肠癌组织与正常组织中的表达。2.用免疫荧光的方法证实FOXK1与FHL2在结直肠癌细胞中的表达与定位。3.利用免疫共沉淀验证FOXK1与FHL2间的相互作用,探讨两者的关系。4.评估FOXK1和FHL2对结直肠癌预后的影响。87例结直肠癌组织芯片分别FOXK1和FHL2染色,相关性分析验证FOXK1与FHL2的相互作用,生存分析评估其对结直肠癌预后的影响。5.下调FHL2验证FOXK1与FHL2在结直肠癌中的相互作用。5.1建立稳定表达株Vector,及FOXK1,并在此基础上瞬转FHL2 siRNA(FOXK1-FHL2 siRNA)。5.2 EdU细胞增殖实验、划痕实验、Transwell细胞侵袭实验探究下调FHL2对FOXK1诱导的结直肠癌细胞增殖、侵袭、转移能力的影响。5.3观察三组细胞形态变化、罗丹明鬼笔环肽染色观察细胞骨架变化、Western blot 检测三组细胞 E-cadherin、Vimentin、Snai1、MMP2、MMP9 的表达。探究下调FHL2对FOXK1诱导的结直肠癌细胞的EMT的影响。6.收集结直肠癌淋巴结转移患者的淋巴结,免疫组化验证FOXK1和FHL2在转移瘤中的表达。7.建立裸鼠皮下成瘤模型、脾被膜下肝转移模型和尾静脉肺转移模型,体内验证压低FHL2表达对FOXK1诱导的侵袭转移作用的影响。结果1.FOXK1在结直肠癌组织中的表达高于正常组织;2.FOXK1和FHL2在结直肠癌组织细胞的表达呈正相关;3.FOXK1与FHL2在结直肠癌中存在相互协同作用;4.FHL2siRNA抑制体内外FOXK1诱导的结直肠癌细胞的增殖、EMT、侵袭和转移。结论FOXK1与FHL2在结直肠癌的增殖、EMT、侵袭和转移中具有协同作用,因此,FOXK1和FHL2可能作为结直肠癌的综合治疗的靶基因。