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细胞色素P450酶(CYP)是一种能够氧化多种底物的血红素硫氢酸盐类酶,在类固醇类物质合成、前致癌剂激活、药物代谢等方面发挥重要作用,最新研究表明细胞色素P450酶也参与炎症反应。CYP3A29是猪CYP3A亚家族的主要功能酶。猪支原体肺炎是由肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道传染病,本课题组前期研究发现猪CYP3A29基因表达与肺炎支原体感染引发的炎症反应关系密切。目的：通过构建稳定表达CYP3A29基因的猪肺泡巨噬细胞系,探讨CYP3A29基因在肺炎支原体感染炎症反应过程的作用。方法：RT-PCR获取猪CYP3A29基因序列,目的片段与pMD18-T目连,得到pMD18-T-CYP3A29重组质粒并测序验证,用Xhol和NotI对重组质粒及pcDNA3.1(+)/zeo进行双酶切,分别获取线性DNA片段,用T4DNA连接酶将二者连接,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/zeo-CYP3 A29,并对其进行双酶切验证,扩增阳性克隆,提取质粒,并以脂质体2000将其转染至猪肺泡巨噬细胞系3D4/21,zeocin抗性筛选后,RT-PCR及Wesrern-blot鉴定基因表达。猪肺炎支原体感染不同处理组细胞,检测炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PPAR-y受体基因的表达情况。结果1、克隆获取猪CYP3A29基因序列,经与NCBI上相应序列比对分析,同源性达99%。2、成功构建CYP3A29基因真核表达载体。3、zeocin浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml的完全细胞培养液培养细胞,300μg/ml组、250μg/ml组细胞分别在第5天和第7天全部死亡,200μg/ml组细胞在第11天全部死亡,此时150μg/ml组还有细胞存活。4、24孔板培养的细胞,以125ng/孔、250 ng/孔、375 ng/孔、500 ng/孔四种不同浓度的重组DNA转染,500ng/孔组转染效果最好。5、转染筛选到的细胞,RT-PCR检测到目的条带、western-blot检测到CYP3A29的表达。6、Mhp刺激不同处理组PAM均能引起相关炎性因子表达上调,其中CYP3A29基因过表达组细胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达量出现极显著上调(P<0.01)分别出现在4h、8h、4h、8h,正常组细胞和空载组细胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达量极显著上调(P<0.01)分别出现在18h、12h、12h、12h(空载组细胞未见极显著上调)；在Mhp刺激相同时间时,CYP3A29基因过表达组细胞与正常组和空载组细胞相比较IL-1β的表达量在4h、8h差异极显著(P<0.01),12h时差异显著(P<0.05),IL-6的表达量在8h时差异显著(P<0.05),IL-8的表达量在4h时差异极显著(P<0.01),8h、18h时差异显著(P<0.05),TNF-a的表达量在8h、12h、18h时差异极显著(P<0.01)。7、Mhp刺激后,不同处理组细胞PPAR-y的表达量在18h时出现短暂上调,且各个时间段检测结果表明CYP3A29基因过表达组细胞PPAR-y的表达量均显著低于正常组和空载组细胞。结论：1、获得了能够用于后续实验的CYP3A29基因CDS区片段,成功构建了含有CYP3A29基因的真核表达载体。2、优化了细胞转染体系及转染过程中的药物筛选浓度；成功构建了稳定表达CYP3A29基因的猪肺泡巨噬细胞系。3、CYP3A29基因过表达组细胞对Mhp的敏感性和反应强度显著高于正常组和空载组,证实猪CYP3A29基因参与肺炎支原体感染炎症反应过程。4、CYP3A29基因与PPAR-γ受体的表达相关。