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将高效的生物元器件进行重组,并整合到生物合成基因簇的特定位点,增强次级代谢产物的合成。本研究以西索米星产生菌—依纽小单孢菌为模式菌,采用分子遗传技术,将功能强大的噬菌体生物元器件和调控机制清晰的乳糖操纵子元器件整合到依纽小单孢菌的西索米星生物合成基因簇(SBGC)中,研究这些元器件对小单孢菌生长发育的影响,特别是对次级代谢能力提高幅度的影响。1.生物元件T7promoter插入到西索米星生物合成基因簇的下游特定位点。以西索米星生物合成基因簇(登记号:JF431003)为模板,并以基因簇的CDS28与CDS29之间的序列为T7 promoter的插入位点,利用PCR技术扩增其插入位点的上下游序列作为同源交换臂;以温敏型质粒pKC1139为基本载体,构建含T7promoter的重组质粒pHB202。经接合转移,将pHB202导入到TS388,获得单交换菌株DTS202-1、DTS202-2。经影印筛选,获得双交换菌株TS202,成功地在西索米星生物合成基因簇的CDS28与CDS29之间插入T7启动子。TS202菌株斜面生长形态与亲株TS388无异;发酵单位没有明显差异,仅为228u/mL。由此推测出T7promoter的插入对菌株的生物合成没有显著影响。2.重组生物元器件插入到西索米星生物合成基因簇的上游特定位点。将噬菌体的T7promoter和T7RNA聚合酶基因和乳糖操纵子的元器件(lacI-lacP-lacO)重新组合,构成重组生物元器件(lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter),以温敏型质粒pKC1139为基本载体,采用相同方法构建含该重组生物元器件的质粒pHB213。经接合转移导入到TS202,获得工程菌DTS213,成功地在西索米星生物合成基因簇的16SrRNA与CDS2之间插入重组生物元器件。3.工程菌DTS213生物学特性研究。工程菌DTS213形态考察:其生长速度大大加快,转色时间短,菌丝细长,发酵液为深红色;发酵实验结果显示:1)不加诱导物,其发酵单位下降为114u/mL,推测该菌株的生物学特性受到外源DNA大片段插入的影响;2)加入乳糖诱导,其发酵单位继续下降至58u/mL,推测可能是小单孢菌缺乏乳糖透过酶或β-半乳糖苷酶所致;3)加入IPTG,发酵单位上升,而IPTG终浓度为0.01mmol/mL时,发酵单位升至最高,为556u/mL,约为出发菌的2.5倍。结果说明IPTG解除了lacI的抑制作用,并大量表达T7RNA聚合酶,进而高效转录西索米星生物合成基因,最终大幅度提高了次级代谢产物的发酵单位。4.(lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter)插入基因簇的上游特定位点。同样以16SrRNA与CDS2之间的序列为这些重组生物元件的整合位点,构建质粒pHB224,经接合转移导入到TS202,经过反复的接合试验,未能获得接合子。