雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）是我国一种传统的杀虫植物，体内含有多种重要的农用活性物质，但由于该种植物资源稀缺、活性物质含量低、化学合成难度大等因素，严重制约着雷公藤杀虫植物在农药研究领域中的广泛应用。稳定高产离体培养体系的优化与放大以及通过代谢途径工程调控活性物质生物合成是解决上述问题的有效途径。在前期研究中，一方面雷公藤离体培养缺乏深入优化且没有进行放大，而另一方面雷公藤活性次生代谢物生物合成及其调控相关基因的缺失限制着代谢途径工程的实施。本研究针对上述两个问题进行了较为系统的研究，得到如下结果和结论：1.通过建立雷公藤悬浮细胞团培养体系，对其中不同大小和类型细胞团的生长和次生代谢物的累积进行了研究，结果发现，生长缓慢的细胞团（如绿色细胞团）体内的次生代谢物含量相对较高，而生长较快的细胞团（如2mm细胞团）体内次生代谢物含量远低于自然植株，因而，该细胞团培养体系不适用于工业化生产。2.通过建立雷公藤不定根离体培养体系以及对其生长和生产特性进行研究，发现其内酯醇、吉碱和次碱的含量较悬浮细胞团高。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）诱导后3种次生代谢物的产量显著增加；XAD-7树脂对3种次生代谢物的吸附效率均较高。试验结果进一步证明，树脂不但保护了生物碱免于分解，并且由于消减了反馈抑制调节，从而进一步增加了3种代谢物的产量。结合诱导与吸附，不定根培养体系中内酯醇和吉碱的产量（652.14，1378.70μg/flask）比自然根（132.77，454.00μg/g）高出数倍，使这种培养体系具有用于工业化生产雷公藤内酯醇和吉碱的潜力。基于以上结果，将不定根置于一种改良的冒泡柱式反应器中培养，其含量与摇瓶相当，但是不定根的生长较差，仍需后续试验对培养条件进行优化。3.雷公藤抑制差减杂交cDNA文库成功富集了与MeJA诱导相关的基因。长时间MeJA处理使差减文库富集了大量有价值的途径下游的基因，如CYP450等。从文库中共发现11个推测与萜类和生物碱生物合成相关的基因，9个推测与调控相关的转录因子以及2个推测与次生代谢物转运相关的转运蛋白基因。通过对MeJA处理样品中基因表达量的测定，进一步验证了这些基因与MeJA及次生代谢物生物合成的相关性。MeJA诱导文库的构建有利于发现与次生代谢物合成相关的基因，排除不相关的旁系同源基因，从而为后续通过代谢途径工程提高目标物质产量提供了宝贵信息。4.原核表达TwHf714得到了融合有HIS尾链的融合蛋白。TwHf714可以催化二氯甲烷和甲醇（9:1, v/v）段提取物中的一种化合物生成另一种保留时间稍长的产物。由于两种化合物的保留时间与内酯醇的不符，故推测TwHf714可能没有参与内酯醇的生物合成。进一步尝试运用LC-MS鉴定底物和产物的结构时发现，两种物质均具有五环三萜类化合物的特征离子峰，但是由于不能将复杂多样的五环三萜类化合物有效分离，致使不能准确找出两种化合物的分子离子峰。雷公藤体内的五环三萜salaspermic acid具有五元内酯环结构，因此，TwHf714可能参与到了催化polpunonic acid的反应中。后续可以通过选用更高效的分离技术或植物化学制备分离得到雷公藤萜类合成中间体的方法进一步揭示TwHf714基因的功能。5.利用RNAi干扰鉴定与TwHf362同源的基因TwHfCYP-1时发现，TwHfCYP-1干扰系中基因表达量的下降程度与两种生物碱含量的下降程度均呈正相关，证明了TwHfCYP-1参与着不同倍半萜吡啶生物碱所共有的生物合成步骤。本研究一方面可以帮助揭示雷公藤倍半萜吡啶生物碱的生物合成机理，另一方面也提供了一种研究雷公藤基因功能的方法。6.生物信息学分析初步证明TwMDR1（TwHf70）转运蛋白定位于根组织的质膜上并具有将生物碱转入细胞的功能。与雷公藤不定根培养体系相比，雷公藤发状根培养体系中次碱的释放率较低。通过qRT-PCR分析得出，TwMDR1在发状根中的表达量是不定根中的3.56倍，而另一种推测为生物碱运出蛋白的TwMATE1在两种组织中的表达量差异不显著。这些结果可以初步证明低释放率是较高表达水平的转入蛋白TwMDR1所引起，而非较低水平的转出蛋白TwMATE1。另外，TwMDR1与TwMATE1可以同时被MeJA所诱导，其表达增量的比值与次碱的释放率呈相关关系，初步证实两种不同类型的转运蛋白共同影响着代谢物的转运。本研究建立了一种较为适合雷公藤工业化生产的方案，初步揭示了内酯醇和倍半萜吡啶生物碱生物合成、合成调控及转运的机理，对利用离体培养来工业化生产雷公藤活性次生代谢物具有一定的指导意义，且为后期代谢途径工程提供了相关的信息和方法。