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目的:骨关节炎是以关节软骨退行性变和继发性软骨、滑膜增生为特征的慢性关节疾病。既往研究表明,骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者的滑膜组织中表达量升高,且与骨关节炎密切相关,但其机制尚不明确,另一方面,研究显示细胞内NF-κB通路在OA患者的关节软骨、滑液及滑膜等组织中大量激活,产生相应细胞内效应,影响骨关节炎的进展。本研究通过对照正常膝关节与OA患者膝关节成纤维滑膜细胞中NF-κB通路相关蛋白和OPN表达变化,探讨人膝骨关节滑膜炎的通路机制,为治疗骨关节疾病提供新思路。方法:1.术中收集20例原发性膝骨关节炎患者滑膜标本,男性8例,女性12例,平均年龄67.2±8.5岁,对照组选取15例同期因膝关节内骨折行急症手术,以及半月板或关节韧带损伤3日内行手术治疗的患者滑膜标本,男性9例,女性6例,平均年龄34.5±7.8岁。行HE染色对比两组膝关节滑膜组织病理变化;采用免疫组化法与免疫荧光法分别处理两组滑膜标本,并观察正常及OA患者膝关节滑膜组织中OPN及NF-κB通路相关蛋白p65、IκBα、p-p65的表达以及通路激活情况。2.采用酶消化法处理正常与OA患者滑膜组织,分别分离培养第一代滑膜细胞进行分组干预培养,采用文献报道的siRNA序列合成OPN-siRNA,导入两组滑膜细胞内干扰正常OPN合成,与无意义Con-siRNA作阴性对照,分为(1)正常滑膜细胞+OPN-siRNA;(2)正常滑膜细胞+Lipofectamine 2000;(3)OA滑膜细胞+OPN-siRNA;(4)OA滑膜细胞+Lipofectamine 2000四组。培养至第四代成纤维滑膜细胞形态学观察,并行蛋白质印迹法(Western blot)检测膝关节成纤维滑膜细胞中OPN及NF-κB通路中p65和磷酸化p65蛋白表达,β-actin作为内参蛋白。3.用ImageJ图像分析软件对相同倍数视野内行免疫组化法测定的两组滑膜组织中OPN和NF-κB相关蛋白的阳性表达区域。提取培养滑膜细胞蛋白,Western blot法得到的显影蛋白条带,以Image J软件分析滑膜干预实验中各蛋白条带灰度值,将得到的NF-κB通路相关蛋白的均一化除以β-actin的结果,得到各组的相对定量值。采用SPSS19.0统计软件处理,根据正态分布及方差齐性与否行独立样本t检验或Wilcoxon秩和检验,P<0.05表示差异有统计学意义,并分析OPN经NF-κB信号通路对膝关节滑膜炎性增生产生的影响。结果:HE染色见OA滑膜组织内层细胞显著增生,间质血管增生紊乱、炎性细胞浸润;免疫组化与免疫荧光显示,OA患者滑膜病理标本中OPN及NF-κB信号通路蛋白表达明显高于正常人;Western blot显示OA组细胞内OPN及细胞通路蛋白p65、P-p65表达高于正常滑膜细胞,经过干预的OPN-siRNA实验组成纤维滑膜细胞中p65、p-p65通路蛋白较对照组减少,差异有统计学意义。结论:OA患者膝关节成纤维滑膜细胞通过OPN过量表达,通过激活NF-κB信号通路,产生下游效应,影响骨关节炎病情发展。这可能是滑膜炎症影响OA发病机理的重要组成部分。