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为研究海洋磷细菌在磷酸盐再生过程的溶磷机理,丰富海洋磷细菌的研究,进一步研究海洋磷细菌和微生物参与水体磷循环转化过程提供参考,本论文从印度洋水体筛选获得可培养有机磷细菌,对其多样性和溶磷特性进行研究,并对分离自即墨大桥盐场底泥的海洋中度嗜盐细菌进行了全基因序列分析和溶磷基因的克隆,主要结果如下: 1.本文采用卵磷脂平板筛选的方法,根据菌体周围是否有溶磷圈,从印度洋水体样本中共分离获得99株有机磷细菌,经过16Sr RNA基因测序比对和系统发育分析得出,共分属于16个菌属,其中,菌属数量最多的是远洋橄榄球形菌属,其次是盐单胞菌属。用DNA Star软件进行序列比对得出有28种不同种的有机磷细菌,种数类别最多的菌属是盐单胞菌属,其次是副球菌属。这说明,在印度洋水域中的有机磷细菌存在着较为丰富的种群多样性,且对印度洋水域中有机磷的转化循环起着重要的作用。 2.通过磷酸苯二钠法进行胞外碱性磷酸酶的平板筛选结果显示,对于India-BSP-2、India-BSP-5、India-BSP-6、India-BSP-8四株没有胞外碱性磷酸酶活性但有溶磷现象的菌株,推测可能是其他的磷酸酶作用机制。对India-BSP-1、India-BSP-21和India-BSP-23进行卵磷脂液体发酵培养,用pH计测发酵液中的pH,发现pH的下降与有机磷细菌分泌有机酸或者卵磷脂的降解产物有关,但并不是溶磷的必要条件;采用钼蓝比色法测定发酵液中的活性磷(Dissolved inorganic phosphorus,DIP)浓度发现,DIP浓度曲线为N型,主要是因为DIP和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, APase)的相互作用。DIP浓度与APase浓度的高峰存在滞后性,且APase浓度明显反比于DIP浓度。3株菌所对应的DIP浓度和APase浓度均不同,故其溶磷能力各异,可能是细菌磷浓度控制的阀值位点不同。 3.采用CTAB-SDS法对一株分离自即墨市大桥盐场的底泥样本中海洋中度嗜盐溶磷细菌Kushneria sp.YCWA18提取基因组DNA进行全基因组序列分析。分析结果显示菌株Kushneria sp.YCWA18全基因组大小为3,605,658bp,共预测基因3982个,其中有3580个蛋白获得COG功能注释,主要为一般功能预测、氨基酸代谢及转运、糖类转运及代谢、能量产生及传递、转录类的蛋白数量占优势;对其进行GO功能预测,共有2237个基因获得GO注释,主要为细胞、细胞部位、催化活性、结合、代谢过程、细胞内过程的基因数量占据优势,以上表明菌株活性多集中于细胞分化、酶催化及代谢等。 4.通过对Kushneria sp.YCWA18全基因组在京都基因组和基因组百科全书数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)代谢通路的注释,根据文献报道,挑选溶磷基因:pqqE、pqqC、ppk、ppx、phoA1、phoD,进行相关基因克隆和序列分析。对基因pqqE、pqqC、ppk、ppx、phoA1、phoD进行GenBank号注册,分别是KU942382~KU942387。基因序列进行Blastn比对发现,基因pqqC、pqqE、phoA1、ppk、ppx与Chromohalobacter salexigens DSM3043同源性分别是76%、75%、69%、75%、68%,基因phoD与Pseudomonas oryzihabitans strain USDA-ARS-USMARC-56511同源性是78%。使用National Center for Biotechnology Information(NCBI)在线对克隆的基因进行开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)预测并将蛋白序列进行Protein Blast,蛋白pqqC、phoA1、phoD与Kushneria aurantia同源性分别为为87%、64%、53%;蛋白pqqE与Chromohalobacter japonicus同源性为77%;蛋白ppk与Halomonadaceae bacterium T82-2同源性为76%;蛋白ppx与Halomonas salina同源性为61%,以上结果表明蛋白phoA1、phoD可能为新的功能蛋白。蛋白pqqC、pqqE属于吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone,PQQ)合成酶类;蛋白ppk、ppx属于多聚磷酸盐代谢酶类;蛋白phoA1、phoD属于碱性磷酸酶类。