背景:关节软骨覆盖在关节表面,是关节实现正常功能的重要结构。关节软骨的组成成分包括软骨细胞和细胞外基质,细胞外基质主要包括胶原和蛋白多糖,而细胞成分只有软骨细胞一种。软骨细胞可分泌新基质,并降解老化和受损的基质,以维持软骨结构的完整性。负重是关节软骨的基本功能,关节负重首先使关节软骨受到直接的压应力。研究显示力学应力可调节软骨的基因表达。正常生理应力可促进软骨表型相关基因的表达和基质蛋白分泌。相反,异常的机械应力(如应力过大或丧失)可诱发或促进软骨的退变,软骨退变最终会导致骨关节炎。虽然大量研究都证实力学应力和软骨有密切的关系,但是力学传导的机制,即软骨细胞如何感应和传导力学信号,仍然不明了。组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)特异性地分布在脑组织、心肌组织、骨骼肌肉和软骨组织中。敲除HDAC4的基因鼠表现为软骨细胞早期、异常的肥大,和异位骨化,最终在出生前后死亡。HDAC4有一奇特能力,可在细胞核和细胞浆之间穿梭。已有的研究显示,HDAC4在细胞核内外的穿梭对肌肉细胞分化,神经细胞功能的发挥起着重要的调节作用。我们实验室以往的研究显示,HDAC4细胞核内外的穿梭在生长板骺软骨细胞的分化中起决定性的调节作用。但还不清楚,机械应力是否能诱导HDAC4核内外移动。本研究旨在观察压应力对HDAC4细胞核内外移动的影响,及HDAC4细胞核内外的移动在力学调节软骨细胞基因表达中的作用。目的:(1)应用Flexcell?FX-5000?压应力加载系统对体外立体培养的软骨细胞施加压应力,观察压应力对软骨细胞内HDAC4核内外移动的影响。(2)应用Flexcell?FX-5000?压应力加载系统对体外立体培养的软骨细胞施加压应力,分析压应力引起的hdac4核内外移动对软骨细胞基因表达的影响,探讨hdac4核内外移动在压应力调节软骨细胞基因表达中的作用。(3)应用flexcell?fx-5000?压应力加载系统和软骨细胞体外立体培养,探讨压应力诱导hdac4核内外移动的机制,及hdac4核内外移动调节软骨细胞基因表达的机制。方法:本课题包括以下五方面研究:(1)软骨细胞立体培养及压应力作用时间的选择。包括以下几方面内容:(1)6天龄幼鼠(c57bl/6)软骨细胞的分离和体外培养;(2)绿色荧光蛋白(gfp)标记的hdac4(gfp-hdac4)腺病毒载体的体外扩增和转染体外培养的鼠软骨细胞;(3)将转染gfp-hdac4的软骨细胞移至2%藻酸盐水凝胶中,继续立体培养;(4)应用flexcell?fx-5000?压应力加载系统,对体外立体培养的软骨细胞施加压应力,观察不同作用时间对基因表达的影响,以选择最佳的负载时间。(2)观察压应力对软骨细胞内hdac4核内外分布的影响。主要实验内容如下:(1)应用flexcell?fx-5000?压应力加载系统,对体外立体培养的软骨细胞施加最佳负载时间的压应力,应用激光共聚焦显微镜观察软骨细胞内hdac4核内外分布的变化;(2)对受力后软骨细胞的细胞浆蛋白和细胞核蛋白进行分离提取,应用west-blot分析细胞浆内hdac4和细胞核内hdac4含量在压应力作用前后的变化。(3)观察压应力对软骨细胞代谢、增殖及分化的影响。具体实验内容如下:(1)应用rt-pcr检测软骨细胞受到压应力后蛋白聚糖、ii型胶原、lk1、sox9、cdkn1a、x型胶原、mmp-13、ihh和runx2基因表达的变化;(2)应用safranin-o染色评价压应力对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响,应用west-blot评价压应力对软骨细胞分泌ii型胶原的影响;(3)应用edu细胞增殖检测法评价应力对软骨细胞增殖的影响;(4)进一步行i型胶原和ii型胶原免疫组织化学染色,评价应力对软骨细胞分化的作用。(4)探讨压应力诱导hdac4细胞核内外再分布的机制。实验内容有:(1)首先,应用免疫共沉淀和west-blot检测压应力对软骨细胞内hdac4磷酸化的影响;(2)然后,应用蛋白磷酸酶2a(pp2a)免疫沉淀磷酸酶检测试剂盒观察压应力对pp2a活性的影响。(5)应用pp2a抑制剂,冈田酸(okadaicacid,oa),进一步证实压应力促进hdac4细胞核内外移动是通过pp2a去磷酸化hdac4途径来调控的。又分以下几个实验:(1)验证pp2a抑制剂,oa,阻止压应力诱导的hdac4细胞核内移。应用激光共聚焦显微镜观察软骨细胞内hdac4核内外分布的变化,分离提取受力后软骨细胞的细胞浆蛋白和细胞核蛋白,应用west-blot分析细胞浆hdac4和细胞核hdac4含量在压应力作用后的变化;(2)证实是否oa抑制压应力诱导的hdac4去磷酸化。应用hdac4抗体对分离的软骨细胞核、浆蛋白进行免疫共沉淀,之后应用抗磷酸化丝氨酸的抗体进行west-blot检测磷酸化的hdac4。(3)应用pp2a免疫沉淀磷酸酶检测试剂盒,检测oa是否抑制pp2a活性;(4)应用rt-pcr观察oa是否抑制压应力诱导的软骨细胞基因表达变化;(5)应用hoechst33342/propidiumiodide(pi)双染细胞凋亡检测试剂盒,观察oa是否诱导软骨细胞死亡。结果:(1)软骨细胞立体培养及压应力最佳作用时间。(1)鼠软骨细胞分离和体外培养成功;(2)含gfp-hdac4腺病毒载体的体外扩增成功,并可对体外培养鼠软骨细胞高效转染;(3)转染gfp-hdac4的软骨细胞在2%藻酸盐水凝胶中立体培养生长良好,激光共聚焦显微镜观察显示,在2%藻酸盐水凝胶中立体培养一周,软骨细胞gfp-hdac4的表达率约89.8%(86.9%~92.6%);(4)应用flexcell?fx-5000?压应力加载系统,对体外立体培养的软骨细胞施加压应力:0.5hz正弦波形变化,0~20kpa压应力强度变化(0.5hz,20kpa),施压2小时和3小时时间点蛋白多糖和ii型胶原的mrna表达都明显增加(p<0.05),但施压4小时后mrna表达较3小时时间点减少(p<0.05),因此选择3小时压应力(0.5hz,20kpa)作为负载条件。(2)压应力促进hdac4进入软骨细胞核。(1)激光共聚焦显微镜观察显示,在未受力的立体培养软骨细胞中,hdac4主要分布在细胞浆;而在受到3个小时压应力的软骨细胞中,hdac4主要分布在细胞核。比较hdac4主要分布在细胞核内的细胞数,受应力组明显高于未受应力组(p=0.009)。(2)免疫共沉淀实验进一步证实,细胞浆内hdac4蛋白含量,未受力组明显高于受力组;而细胞核内的hdac4蛋白含量,受力组明显高于未受力组。这些实验证实,压应力诱导hdac4从细胞浆移动到细胞核。(3)压应力调节软骨细胞基因表达。(1)rt-pcr检测显示,软骨细胞受到压应力后蛋白聚糖、ii型胶原、lk1和sox9的mrna表达显著升高(p<0.05),而cdkn1a、x型胶原、mmp-13、ihh和runx2的mrna表达显著降低(p<0.05);(2)safranin-o染色显示,压应力组软骨细胞周围的红染程度比对照组显著深;west-blot检测显示,压应力组的ii型胶原蛋白量明显高于对照组;(3)edu检测显示,压应力组细胞的阳性率明显高于对照组(p=0.0047);(4)免疫组织化学染色显示,压应力组细胞的ii型胶原染色阳性,i型胶原染色阴性。以上结果证实压应力促进软骨细胞的代谢和增殖,并抑制其分化。(4)压应力使hdac4去磷酸化,并增加pp2a活性。(1)免疫共沉淀和west-blot检测显示,压应力可使软骨细胞内hdac4去磷酸化;(2)pp2a免疫沉淀磷酸酶检测显示,压应力可增加pp2a活性。(5)冈田酸(okadaicacid,oa)抑制实验。(1)oa阻止压应力诱导的hdac4细胞核内移。激光共聚焦显微镜观察显示,添加抑制剂oa后,软骨细胞受到压应力,hdac4仍然主要分布在细胞浆。west-blot分析显示,添加抑制剂oa后,软骨细胞即使受到压应力,细胞浆和细胞核内的hdac4含量与未受压应力的对照组相比变化也不明显;(2)免疫共沉淀和west-blot检测证实,加抑制剂oa后压应力不能使hdac4去磷酸化;(3)pp2a免疫沉淀磷酸酶检测显示,加oa后压应力不能增加pp2a活性;(4)rt-pcr检测显示,与压应力组比较,oa+压应力组中蛋白聚糖、ii型胶原、lk1和sox9的mrna表达显著降低(p<0.05),而cdkn1a、x型胶原、mmp-13、ihh和runx2的mrna表达显著增高(p<0.05);(5)应用hoechst33342/propidiumiodide(pi)双染细胞凋亡检测试剂盒观察显示,oa不诱导软骨细胞死亡。结论:本实验首次发现:(1)压应力可促进hdac4由细胞浆进入细胞核;(2)hdac4进入细胞核后,可调节软骨细胞基因表达,压应力通过促进hdac4进入细胞核来调节软骨细胞基因表达;(3)压应力通过增加PP2A活性,去磷酸化HDAC4,来调节HDAC4进入细胞核。